1. 引言
楠竹(Phyllostachys pubescens)又名毛竹，为禾本科(Poaceae)竹亚科(Bambusoideae)刚竹属(Phyllostachys)植物，分布于我国秦岭、大别山、汉水流域至长江流域以南各省，南至华南北部，西至云贵高原东侧，是我国栽培面积最广的竹类资源，占全国竹林面积的70%左右 [1] 。竹子具有生长快、适应性广以及多方面生态效益等特点，在建筑、交通、水利、农业、手工业、造纸业等领域都有广泛的应用，然而，作为竹子加工利用后的废弃物—竹叶虽然在我国有悠久的药用和食用历史，但是对其开发利用相对滞后 [2] 。黄酮类化合物是楠竹提取物中的主要活性成分，竹黄酮类化合物有类似超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的作用 [3] [4] ，具有优良的清除自由基，抗氧化，抗衰老，预防心脑血管疾病以及保护肝脏，抗癌症，美化肌肤等功效 [5] 。因此，竹黄酮是一种非常有应用前途的药物、化妆品天然添加剂、食品抗氧化剂，在多个领域有着广泛的应用潜力。根据文献，竹黄酮类化合物常见的提取方式有热水提取、超声波提取、酶提取、超临界CO2萃取、回流提取法等多种方法 [6] 。热水提取法得到的提取液杂质较多，并且高温会破坏黄酮的结构；超声波提取法不适于工业化生产，规模较小；酶提取法可能会破坏黄酮类物质的有效成分，生成其他杂质；萃取法得到的黄酮提取率较低，时间过长；超临界CO2萃取法投资较大，运行成本较高 [7] ，因此需要一种方法简单、设备简易、溶剂用量少、稳定性好、生产成本低的方法从楠竹叶中提取总黄酮。本研究通过单因素法对匀浆辅助空化提取楠竹叶中总黄酮的实验条件进行优化，然后对竹黄酮提取液进行酸碱以及光热稳定性分析，还对匀浆辅助及空化萃取的机理进行了详尽的阐释，为楠竹黄酮的开发利用提供理论依据。
2. 实验
2.1. 材料与仪器
楠竹叶于2016年10月从四川宜宾竹林收集，粉碎后(40~60目)作为总黄酮的提取原料。
BL25B12型匀浆机(200 W，广东美的生活电器制造有限公司)，KQ-100B型超声机(昆山超声设备有限公司)，SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，TU-1900双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，UVA，UVB，UVC灯(TL-D，20W，PHILIPS)，圆柱形，梨形空化设备均为自制(圆柱形300 × 20 mm，梨形1 L分液漏斗)。
芦丁对照品购自中国药品生物制品检定所，纯度大于98%。整个实验中所用到的去离子水是由Milli-Q去离子水纯化系统(Millipore，美国)纯化，经过0.45 μM的过滤膜(广福化学试剂有限公司，天津，中国)过滤之后，应用于紫外光谱分析。
2.2. 实验方法
2.2.1. 楠竹叶含水率的测定
精密称取楠竹叶片粉末1.00 g (三份)，放入105℃ ± 3℃的烘箱干燥至恒重，计算含水率为5.99%。
2.2.2. 楠竹叶总黄酮含量测定
芦丁为对照品测定总黄酮含量的方法改良如下：2.50 mg芦丁溶解在50 mL甲醇作为对照品储备液(0.05 mg/mL)，依次稀释2倍配制一系列标准溶液，取1.0 mL标准溶液加入到10 mL容量瓶中，依次加入1.0 mL 5% (W/V)的亚硝酸钠溶液，1.0 mL 10% (W/V)氯化铝和6.0 mL 4% (W/V)氢氧化钠，以蒸馏水定容至10 mL，混合15 min后，移入比色皿中。以蒸馏水为空白对照，用紫外可见分光光度计测定500 nm处的吸光度 [8] ，吸光度与浓度线性回归得芦丁标准曲线(Y = 8.3201X + 0.0065，R2 = 0.9999)，芦丁对照品在3.125~50 µg/mL范围内，浓度与吸光度有良好的线性关系。
以上述方法取1.0 mL样品加入到10 mL容量瓶中，依次加入1.0 mL 5% (W/V)的亚硝酸钠溶液，1.0 mL 10% (W/V)氯化铝和6.0 mL 4% (W/V)氢氧化钠，以蒸馏水定容至10 mL，混合15 min后，移入比色皿中。以蒸馏水为空白对照，用紫外可见分光光度计测定500 nm处的吸光度，再通过标准曲线计算楠竹叶中总黄酮的含量。
2.2.3. 楠竹叶匀浆辅助负压空化提取物的制备
取10.0 g竹叶(绝干)加入140 mL 70%的乙醇水溶液后，放入功率为200 W的匀浆机中匀浆210 s后，将原料与溶剂转移到梨形空化设备中，以200 mL/min空气速率空化萃取50 min后，对提取溶液进行过滤，得匀浆辅助空化提取的竹叶黄酮提取液。以蒸馏水为空白对照，用紫外可见分光光度计测定500 nm处的吸光度，再通过标准曲线计算楠竹叶中总黄酮的含量。
2.2.4. 竹叶黄酮提取物的稳定性测试
精密量取竹黄酮提取液25.0 mL 9份，分别用0.1 mol/L的HCL和NaOH溶液调节pH值至3、4、5、6、7、8、9、10、11, 依据2.2.2项所述方法测定不同pH环境的总黄酮含量，分析其酸碱稳定性。
精密量取竹黄酮提取液25.0 mL 35份，分别于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的水浴锅中避光保温20 h，每隔4 h取样，依据2.2.2项所述方法测定总黄酮含量，分析其热稳定性。
精密量取竹黄酮提取液25.0 mL 25份，分别置于避光，室内日光，UVA灯、UVB灯、UVC灯30 cm处平行照射20 h，每隔4 h取样，依据2.2.2项所述方法测定总黄酮含量，分析其光稳定性。
3. 结果与分析
3.1. 匀浆单因素分析
3.1.1. 匀浆过程中乙醇体积分数对总黄酮提取效果的影响
溶剂浓度是提取过程中的一个重要参数。本实验取10.0 g竹叶(绝干)分别加入140 mL 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇水溶液后，放入功率为200 W的匀浆机匀浆210 s，依据2.2.2项所述方法测定总黄酮含量。由图1(a)，当乙醇体积分数从30%增至70%时，总黄酮提取率由44.45 mg/g升至58.45 mg/g，当乙醇体积分数继续增至80%时，总黄酮提取率反而降至41.24 mg/g。因此，70%乙醇匀浆提取竹叶总黄酮效果最好。
(a) 
(b) 
(c)
Figure 1. Single factor analysis of homogenate extraction of bamboo total flavonoids
图1. 匀浆萃取竹黄酮单因素分析
3.1.2. 匀浆过程中料液比对总黄酮提取效果的影响
为了提高萃取效率，降低溶剂消耗，本实验对料液比进行了优化。取10.0 g竹叶(绝干)分别加入60、80、100、120、140、160、180 mL的70%的乙醇水溶液后，放入功率为200 W的匀浆机匀浆210 s，依据2.2.2项所述方法测定总黄酮含量。由图1(b)，当料液比从1:6至1:14 g/mL时，总黄酮提取率明显增加，由43.24 mg/g增至66.18 mg/g，当料液比从1:14至1:18 g/mL时，总黄酮提取率增加不明显，且成本增加。因此，当料液比为1:14 g/mL时较为合适。
3.1.3. 匀浆时间对总黄酮提取效果的影响
匀浆过程可以粉碎原料，得到均匀的细小颗粒，同时破坏植物细胞壁，匀浆时间会影响粉碎颗粒大小，本实验对匀浆时间进行了优化。取10.0 g竹叶(绝干)分别加入140 mL的70%的乙醇水溶液后，放入功率为200 W的匀浆机分别匀浆10、20、30、60、90、120、150、180、210、240 s，依据2.2.2项所述方法测定总黄酮含量。由图1(c)可知，匀浆时间由10 s增加到210 s时，总黄酮提取率由17.11 mg/g升至63.38 mg/g，增长迅速。这是由于随着匀浆时间延长，植物粒径变小，较小的粒径可以提供更高的比表面积，从而缩短传质路径，提高传质效率。而匀浆时间由210 s增加到240 s时，总黄酮提取率增加较少，只增加了0.16 mg/g。考虑到时间成本及能耗问题，故最佳匀浆时间选择210 s。
3.2. 最佳空化条件的选择
匀浆导致的细胞壁破裂，比表面积的增大加速了空化过程中楠竹叶总黄酮的扩散和传质。空化是一种由负压产生的流体动力过程，由于负压，空气被不断引入空化仪器中，数以百万计的小气泡不断生长，在液体或液固界面溃灭，不仅导致细胞肿胀或细胞壁的击穿，使溶剂可以扩散到楠竹叶颗粒的内部，而且提高萃取溶剂与楠竹叶颗粒之间的碰撞和传质，可以高效的萃取楠竹叶中的总黄酮。
空气流速是影响提取率的关键参数，直接影响溶剂与楠竹叶颗粒湍流、碰撞和传质。而气泡产生于仪器壁，仪器形状也会对气泡产生量有一定影响，进而影响萃取效果。因此我们对空化过程中的仪器形状和空气流速进行优化。取10.0 g竹叶(绝干) 21份，加入140 mL的70%的乙醇水溶液后，放入功率为200 W的匀浆机分别匀浆210 s后，将楠竹叶匀浆提取物分别置于空气流速为100 mL/min的圆柱形空化仪器，空气流速为200 mL/min的圆柱形空化仪器，空气流速为200 mL/min的梨形空化仪器中，空化萃取70 min，每隔10 min取样，依据2.2.2项所述方法测定总黄酮含量。由图2可知，相同的圆柱形空化仪器，空气流速为200 mL/min的提取率始终大于空气流速为100 mL/min，而空气流速均为200 mL/min时，梨形空化仪器提取率始终大于圆柱形空化仪器，这是由于空气流速大，单位时间产生的气泡量大，湍流效果好，有利于碰撞，湍流和传质。而梨形空化仪器底部比表面积大，仪器壁上产生的气泡量大，因仪器上部半径较小，气泡的上升的过程中受到的压力急速减小而破裂，气泡的崩溃产生气蚀，使楠竹叶颗粒的表面被腐蚀，溶剂可以扩散到楠竹叶颗粒的内部，总黄酮转移到溶剂中。因此我们应选取空气流速为200 mL/min梨形空化仪器，使用该仪器空化50 min时，总黄酮提取率明显增加，由52.20 mg/g增至76.05 mg/g，而空化时间增加到70 min时，提取率与50 min时基本持平，因此空气流速为200 mL/min梨形空化仪器空化50 min最佳。
3.3. 竹黄酮提取物稳定性分析
3.3.1. pH对楠竹叶黄酮稳定性的影响
由表1可知，楠竹叶黄酮的pH在5~7时，楠竹叶黄酮含量变化不大，小于1.0%，且始终为浅黄色；pH为3和4时，楠竹叶黄酮含量分别减少8.3%和6.9%，不变色；当pH在8~11时，黄酮由浅黄色变为棕黄色，且pH越大，楠竹叶黄酮含量降低越多，当pH为11时，含量降低12.5%。因此，pH对楠竹叶
Figure 2. Effect of the velocity of air flow, the shape of the equipment and cavitation time on extraction of bamboo total flavonoids
图2. 空化仪器形状，空气流速和空化时间对总黄酮提取效果的影响
Table 1. Effect of pH on the stability of flavonoids extracts from bamboo leaves
表1. pH对楠竹叶黄酮稳定性的影响
黄酮稳定性有一定影响，在提取和使用过程中应将pH控制在5~7之间。而我们提取楠竹叶总黄酮的匀浆辅助空化提取法，整个过程pH始终在5~7之间，避免黄酮的降解。
3.3.2. 受热对楠竹叶黄酮稳定性的影响
由表2可知，楠竹叶黄酮在加热温度为20℃~40℃时，楠竹叶黄酮损失不大，且始终为浅黄色；温度升高至50℃~80℃，楠竹叶黄酮损失较大，且由浅黄色变为棕黄色，尤其在80℃加热20 h后楠竹叶黄酮的保留率仅为56.5%，所以在提取时应注意避免50℃以上的高温。机械粉碎楠竹叶是一个放热过程，在这个过程中，热敏化合物竹黄酮可能会降解，因此我们选取匀浆粉碎的方法，在楠竹叶中加入适量的溶剂可避免匀浆过程中因温度升高而引起的黄酮降解。我们选取的匀浆辅助空化提取楠竹叶黄酮的方法，相比于热水提取法与回流提取法，全程没有加热过程，温度始终在40℃以下，能有效防止楠竹叶黄酮受热分解。因此，匀浆辅助空化是一种极佳的提取楠竹叶中总黄酮的方法。
Table 2. Effect of being heated on the stability of flavonoids extracts from bamboo leaves (mg∙g−1)
表2. 受热对楠竹叶黄酮稳定性的影响(mg∙g−1)
3.3.3. 光照对楠竹叶黄酮稳定性的影响
由表3可知，楠竹叶总黄酮在室内避光条件下损失很少，约为0.5%左右；在室内日光，UVA灯照射下损失较小，20 h后分别还能保留98.8%，90.3%，且颜色始终不变；20 h长时间UVB，UVC灯照射，楠竹叶黄酮不仅会大量降解，分别降解17.6%，39.5%，而且颜色还会由浅黄色变为棕黄色。因此影响竹黄酮稳定性的光照次序为UVC > UVB > UVA。由此可知楠竹叶总黄酮的日照光稳定性较好，但要避免紫外光近距离长时间的照射。
3.4. 匀浆空化机理分析
本研究以楠竹叶为原料，采用匀浆辅助空化的方法萃取总黄酮。匀浆过程可以粉碎原料，不仅得到均匀的细小颗粒，而且破坏植物细胞壁。随着匀浆时间延长，植物粒径变小，较小的粒径可以提供更高的比表面积，从而缩短传质路径，提高传质效率，同时加速了空化过程中楠竹叶总黄酮的扩散和传质。空化是一种由负压产生的流体动力过程，由于负压，空气被不断引入空化仪器中，数以百万计的小气泡不断生长，在液体或液固界面溃灭，不仅导致细胞肿胀或细胞壁的击穿，使溶剂可以扩散到楠竹叶颗粒的内部，而且提高萃取溶剂与楠竹叶颗粒之间的碰撞和传质，可以高效的萃取楠竹叶中的总黄酮。空化过程中空气流速大，单位时间产生的气泡量大，湍流效果好，有利于碰撞，湍流和传质。而梨形空化仪器底部比表面积大，仪器壁上产生的气泡量大，因仪器上部半径较小，气泡的上升的过程中受到的压力急速减小而破裂，气泡的崩溃产生气蚀，使楠竹叶颗粒的表面被腐蚀，溶剂可以扩散到楠竹叶颗粒的内部，总黄酮转移到溶剂中。
4. 结论
本实验对匀浆过程中乙醇体积分数、匀浆时间、料液比以及空化过程中空气流速、空化仪器形状、空化时间等因素，通过单因素试验确定最优参数，并对楠竹叶中总黄酮在光照、受热、酸碱条件下的稳定性进行研究。匀浆辅助空化的方法萃取楠竹叶总黄酮的最佳提取条件为：用1:14 g/mL料液比加入70%乙醇溶液匀浆210 s后，再经梨形空化器以空气流速为200 mL/min空化萃取50 min，总黄酮提取率为76.05 mg/g。通过酸碱稳定性分析，竹黄酮在pH值5~7范围内稳定；通过热稳定性分析得知，低于40℃时竹黄酮类化合物稳定性良好，且始终为浅黄色，当80℃受热20 h，总黄酮含量从64.32 mg/g降至36.37 mg/g，由浅黄色变为棕黄色；通过日光及紫外光照射，发现自然光照射20 h，黄酮类化合物含量基本稳定，
Table 3. Effect of light irradiation on the stability of flavonoids extracts from bamboo leaves (mg∙g−1)
表3. 光照对楠竹叶黄酮稳定性的影响(mg∙g−1)
仅降低1.2%，破坏竹黄酮稳定性的光照次序为UVC > UVB > UVA。本研究为楠竹叶中总黄酮的开发利用提供了理论依据，对楠竹叶的综合利用具有指导意义。
致谢
作者感谢国家重点研发计划(2017YFD0601006)，黑龙江省青年科学基金资助项目(QC2015034)，中央高校基本科研业务费(2572016BB01)，黑龙江省博士后科研启动金(LBH-Q16001)和东北林业大学大学双一流科研启动金(YQ2015-02)的资助。
NOTES
*通讯作者。