1. 引言
非酒精性脂肪肝(NALFD)是指不以酒精为主要诱因而造成的肝脏组织发生弥漫性脂肪浸润、脂肪变性以及肝炎，后期可发展成肝纤维化及肝癌。随着人们生活水平的提高、NALFD的发生率呈逐年上升的趋势，对人们的健康构成较大的威胁。对全球流行病学调查结果显示，NAFLD在成年人中的发病率达20%~30%，其中肥胖人群中的发病率达75% (娜日苏等，2016) [1] 。NAFLD在降低患者生活质量的同时还会诱发许多其他疾病的发生，如糖尿病、心血管疾病等。
近年来，许多中草药成分在非酒精性和酒精性脂肪肝中的防治有较好的效果，主要有生物碱类、总酚酸和总黄酮类、单体酚酸、多糖与聚糖类等。白藜芦醇属蓼科蓼属，是一种非黄酮类多酚类化合物，广泛存在于葡萄科、豆科、蓼科、百合科植物，以及花生和多种药用植物(赵昱等，2010) [2] 。研究发现它具有抗肿瘤、抗心血管疾病、抗炎、抗氧化、抗菌抗病毒、抗衰老、植物雌激素作用和调节免疫等多种生物活性(Molino et al., 2016; Garavaglia et al., 2016; Charytoniuk et al., 2017; Luther et al., 2011) [3] [4] [5] [6] 。在大小鼠的高脂膳食诱导模型中，研究显示RES的干预对NALFD起到较好的治疗作用，可以降低体重、体脂比、肝脏系数和肝脏脂肪蓄积、转氨酶、甘油三脂(TG)以及胰岛素抵抗指数等，减轻肝脏脂肪变性的病理学变化；或增加高密度脂蛋白胆固醇含量 [7] [8] ，但RES对NALFD的防治效果目前还不明确。本研究旨在通过饲喂高脂日粮与注射肝毒素四氯碳酸相结合的方式诱导小鼠NALFD模型，并经口给予RES探讨其对NALFD的预防作用效果。
2. 材料与方法
2.1. 主要试剂
白藜芦醇由湖南农业大学国家植物功能成分利用工程技术研究中心提供；丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、天冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、总胆固醇(TC)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒等购自南京建成生物工程研究所；RNAiso plus购自宝生物工程(大连)有限公司；羧甲基纤维素钠购自长沙市宝生盾科技有限公司；四氯化碳购自北京中杉金桥生物技术有限公司；多聚甲醛购自上海国药集团化学试剂有限公司；苏木素和伊红染色液购自中杉金桥生物技术有限公司。
2.2. 试验动物
本研究中选用ICR雄性小鼠，4周龄，SPF级，体重25~30 g，健康，购置湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2013-0004。购买后适应性饲喂4d后开始实验，期间饲喂常规小鼠料，饲养环境安静，昼夜周期为12 h光照，12 h黑暗，温度25℃ ± 2℃，自由摄食和饮水。本研究中试验动物操作处理严格遵照湖南农业大学动物伦理委员会所制定的规范。
2.3. 试验动物分组与处理
购买的小鼠适应环境后随机分为两组，即正常对照组和高脂模型组，每组15只。正常对照组饲喂常规小鼠日粮(购自湖南斯莱克实验动物有限公司) 7周。高脂模型组饲喂高脂日粮(购自扬州利吉生物医药有限公司) 7周，并于第5周时注射四氯化碳，日粮配方如表1所示。每周称重一次，小鼠自由采食和饮水。实验结束后，收集肝脏和血液分别检测肝脏的形态学变化、血清中转氨酶和血脂的含量变化以确认模型是否构建成功。
Table 1. Formula and nutrients content of the diet
表1. 实验动物日粮配方及营养成分组成
待NAFLD小鼠模型建立后，开展RES预防实验，将小鼠随机分3组，即空白对照组、高脂模型组和RES预防组，具体处理如下：
1) 空白对照组：饲喂常规小鼠饲料，每天灌胃0.5%羧甲基纤维素钠0.2 mL，连续灌胃5周；5周每天按0.1 mL/10g体重腹腔注射生理盐水，每3天一次，共4次。
2)高脂模型组：饲喂高脂饲料，每天灌胃0.5%羧甲基纤维素钠0.2 mL，连续灌胃5周；5周后每天按0.1 mL/10g 体重腹腔注射四氯化碳橄榄油溶液(浓度为0.1%)，每3天注射一次，共4次。
3) RES预防组：饲喂高脂饲料，同时每天灌胃RES溶液0.2 mL (30 mg/kg BW/d)，连续灌胃5周；5周后每天按0.1 mL/10 g体重腹腔注射0.1%的四氯化碳橄榄油溶液，每3天注射一次，共4次。
实验期间，小鼠均自由采食饮水，定期称重。处理结束后，限食16 h后称重，采血离心收集血清，收集肝脏并计算肝脏指数([肝脏重量 ÷ 体重] ´ 100%)。
2.4. 血清转氨酶、血脂和肝脂成分含量的检测
采用比色法检测血浆中转氨酶ALT和AST活力的变化；同时检测血脂和肝脂成分，包括TG、TC、LDL-C和HDL-C等，按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书进行。其中肝脏的脂类物质采用氯仿/甲醇法提取，称取肝脏0.5 g，加入10 mL预冷的氯仿/甲醇(体积比2:1)溶液，用匀浆器匀浆，室温静置1 h，加入2 mL超纯水混匀，3000 rpm离心10 min，取下层的有机相在旋转蒸发仪中干燥，其残留物加入异丙醇充分溶解用于脂质含量的测定。
2.5. 苏木素-伊红染色(H.E.染色)
采用H.E.染色检测肝脏的病理形态学，将肝脏组织用4%多聚甲醛固定后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸腊，包埋，最后切片(厚度为5 μm)。组织切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精复水，H.E.染色，再脱水、透明并用中性树胶封片，在显微镜观察并照相。
2.6. 血清细胞因子检测
血清中细胞因子白介素(interleukin，IL)-2、IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α，采用Luminex多因子检测方法，委托上海莱兹生物科技有限公司完成检测。各细胞因子测量范围：IL-6，4.9~2000 pg/mL；IL-2，1.2~5000 pg/mL；IL-1，1.2~5000 pg/mL；TNF-α：3.7~15,000 pg/mL。
2.7. 数据分析
实验数据采用SPSS 13.0中的one-way ANOVA方法进行多重比较、差异显著性检验分析。结果显示用平均值 ± 标准差(mean ± SD)表示，p < 0.05表示各处理组与对照组相比具有显著差异。
3. 结果与分析
3.1. RES对NAFLD小鼠体重的影响
如图1显示，在高脂诱导的NAFLD小鼠模型中，高脂模型组在诱导第4~5周时体重增长显著高于对照组(p ˂ 0.05)；RES预防处理组体重增长相对于空白对照组虽有升高的趋势，但无显著差异(p > 0.05)。当进一步用四氯化碳处理时，高脂模型组和RES处理组小鼠体重增长缓慢，与对照组体重无统计学差异(p > 0.05)。
3.2. RES对NAFLD小鼠肝脏组织结构的影响
各组小鼠的肝脏病理切片如图2所示。空白对照组肝小叶轮廓清晰，肝索排列整齐，并围绕在中央
结果为平均值 ± 标准差；*表示与空白对照组相比具有统计学意义(p < 0.05)。
Figure 1. Effect of resveratrol on body weight change of NAFLD mice
图1. 白藜芦醇对NAFLD小鼠体重的影响
A：空白对照组；B：高脂模型组；C：白藜芦预防组。放大倍数为100倍。
Figure 2. Effect of resveratrol on liver histopathology of NAFLD mice
图2. 白藜芦醇对高脂诱导NAFLD小鼠肝脏病理形态学的影响
静脉呈放射状，肝窦清晰可见，在汇管区未见炎细胞浸润；高脂模型组其肝细胞的体积增大，排列不整齐，大多细胞的胞浆内含有许多大小不一的圆形脂肪空泡，而且部分区域伴随有少量炎症细胞的浸润；RES预防组，小鼠肝脏脂肪变性程度有较大程度的减轻，肝小叶轮廓较清晰，肝细胞仍可见极少数的脂肪空泡。
3.3. RES对NAFLD小鼠血脂水平的影响
饲喂高脂日粮7周后，小鼠血清中TG、TC和LDL-C的含量均高于空白对照组(p < 0.05)，而HDL-C则低于空白对照组。RES预防组与高脂模型组相比，小鼠血清中TG、TC和LDL-C等指标均呈下降趋势，其中TC和LDL-C显著下降(p < 0.05)，但与空白对照组比还是呈升高趋势(p < 0.05)；此外，RES预防组血清中HDL-C的水平较高脂模型组显著升高(p < 0.05)，与对照组差异不显著(p > 0.05)。具体结果见表2所示。
Table 2. Effect of resveratrol on serum lipids in NAFLD mice
表2. 白藜芦醇对NAFLD小鼠血脂和转氨酶的影响
TG，甘油三酯；TC，总胆固醇；LDL-C，高密度脂蛋白胆固醇；HDL-C，高密度脂蛋白胆固醇；ALT，丙氨酸氨基转移酶；AST，天门冬氨酸氨基转移酶。结果表示mean ± SD，n = 8，其中上标a表示与正常组比差异显著(p < 0.05)，b表示与高脂模型组比差异显著(p < 0.05)。
3.4. RES对NAFLD小鼠肝脏指数和肝脂的影响
小鼠肝脏指数及肝脂成分TG、TC、LDL-C和HDL-C的检测如表3所示，高脂模型组中肝脏指数显著升高(p < 0.05)，同时肝脏匀浆液中TG、TC、LDL-C的含量也显著升高(p < 0.05)，而HDL-C的水平显著下降(p < 0.05)。RES预防组中肝脏指数以及TG和TC的水平相对于高脂模型组显著降低(p < 0.05)，但仍显著高于空白对照组(p < 0.05)；RES对高脂模型组中肝脂成分LDL-C和HDL-C的含量无显著调节作用(p > 0.05)，与空白对照组均具有显著差异(p < 0.05)。
3.5. RES对NAFLD小鼠血清细胞因子的影响
本研究中，利用Luminex多因子检测技术检测了血清中细胞因子IL-2、IL-6、IL-1β以及TNF-α的水平。结果如表4所示，高脂模型组小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-6、IL-1β以及TNF-α的水平显著升高(p < 0.05)；RES预防组小鼠血清中IL-2、IL-6以及TNF-α的水平与高脂模型组相比均显著下降(p < 0.05)，而IL-1β的水平无显著性差异(p > 0.05)，与空白对照组相比，各细胞因子均显著升高(p < 0.05)。
4. 讨论
NAFLD的发展是一个相对较复杂的过程，目前还没有有效的根治方法。根据其病变，由轻到重可以分为单纯性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)和肝硬化三个不同的病理阶段。NASH是NAFLD的一个重要中间阶段，对NAFLD疾病的进展起着决定性的作用。如果NASH预后不佳时则可增加肝硬化的发病率，因此，NASH是药物干预和治疗的关键时期(施军平和范建高，2010) [9] 。许多膳食成分具有无毒无副作用的特点、同时能够通过多靶点进行有效的调控等优点，因此，膳食干预是目前最常用的控制NAFLD发生发展的手段。多酚类化合物是广泛分布于各种膳食如水果、蔬菜、谷物中的化合物，具有较强的抗氧化能力，同时还具有降血脂、降血糖、减肥、抗炎等多种调节作用(Molino et al., 2016; Gato et al., 2013; Luximon-Ramma et al., 2006; Terra et al., 2011) [3] [10] [11] [12] 。大量的研究表明，许多多酚类化合物如葡萄籽提取物、蓝莓多酚、肉桂多酚、白藜芦醇、大豆异黄酮、儿茶素以及姜黄素等对脂肪细胞的分化和脂质代谢具有重要的调节作用，但因其化合物结构不同所以效果也不一(Molino et al., 2016; Xiao et al., 2013) [3] [13] 。
最近的研究阐明，RES对许多种肝脏疾病都有治疗效果，对肝功能具有良好的保护作用。RES通过减少脂肪沉积、坏死以及由缺血所诱导的凋亡显著提高肝脏移植后大鼠的存活；RES能抵抗化学物质、胆汁郁积以及酒精所引起的损伤而保护肝脏；RES还能改善葡萄糖的新陈代谢和血脂，减少脂肪纤维化
Table 3. Effect of resveratrol on liver index and liver lipids in NAFLD mice
表3. 白藜芦醇对NAFLD小鼠肝脂指数和肝脂的影响
结果显示为平均值 ± 标准差，n = 6，其中上标a表示与正常组比差异显著(p < 0.05)，b表示与高脂模型组比差异显著(p < 0.05)。
Table 4. Effect of resveratrol on seral cytokines in NAFLD mice
表4. 白藜芦醇对NAFLD小鼠血清中细胞因子的影响
结果显示为平均值 ± 标准差，n = 6，其中上标a表示与正常组比差异显著(p < 0.05)，b表示与高脂模型组比差异显著(p < 0.05)。
和脂肪变性；此外，RES还能改变脂肪细胞脂肪酸的组成(Wu et al., 2005, 2006a and 2006b; Faghihzadeh et al., 2015) [14] [15] [16] [17] 。因此，在本研究中，通过高脂饮食与腹腔注射四氯化碳相结合诱导建立小鼠NAFLD模型，通过一定剂量的RES干预研究了RES对NAFLD的预防作用。在NAFLD的发生及发展过程中常伴随有高脂血症，高脂血症是动脉粥样硬化和冠心病等心血管疾病的重要危险因素，因此降低血脂水平有着重要意义。本研究结果显示，灌喂RES可显著降低高脂模型组小鼠血清中的血脂成分，包括TC、TG和LDL-C，同时显著升高HDL-C的含量，虽与正常对照还存在差异，但说明RES在一定程度上调节血脂相关成分的水平，并降低发生高脂血症的风险。在其他的类似研究中，也均显示RES能显著降低血脂和/或肝脂水平(任平等，2011；Ali et al., 2016) [18] [19] 。在王晓珂等人的研究中，先用高脂诱导大鼠NAFLD后，再用RES进行干预治疗，也能显著降低TC、TG和LDL-C的水平，升高HDL-C的水平(王晓珂等，2013) [20] 。由此可见，RES不仅对NAFLD具有预防作用，还可有效治疗高血脂症诱发所导致的其余症状。
转氨酶AST和ALT主要存在于肝细胞中，正常情况下AST和ALT在血液中的水平非常低，而当肝脏受到损伤时，肝细胞中的转氨酶被释放出来，从而导致血清转氨酶水平升高，而血清AST和ALT的活性是评价肝功能的两项重要指标。在本研究中，高脂动物模型组血清中的AST和ALT水平均显著升高一倍左右。经口给予RES显著降低了血清中AST和ALT的水平，这说明RES能在一定程度上降低高脂对肝脏造成的损伤，从而改善肝功能。
高脂诱导能导致炎性细胞因子的升高，肝内B (intrahepatic B, IHB)可诱导细胞因子IL-6、TNF-α等的分泌而参与NAFLD的发生(Zhang et al., 2016) [21] 。脂肪肝发病过程中脂质大量堆积于肝脏，当脂质长期大量蓄积时则会发生脂肪变性，可诱发促氧化物质增多并使抗氧化物质减少，从而导致氧应激，使细胞内氧自由基显著增加导致脂质过氧化损伤。脂质过氧化过程中产生大量的活性氧(ROS)、脂质自由基及其降解产物丙二醛(MDA)和4-羟基壬烯酸(HNE)等，这些物质可进一步诱发免疫反应，趋化中性粒细胞，导致炎症细胞的浸润而产生炎症反应。许多研究表明细胞因子在NSFLD的病理发生过程中起着重要作用，细胞因子作为一类重要的调节因子，参与调节机体对胰岛素的敏感性，肝脏脂质的蓄积，肝脏损伤及炎症，肝纤维化和肝硬化等(Carterkent et al., 2008) [22] 。在本研究中，使用Luminex法对血清中的部分细胞因子进行了分析，高脂诱导能使细胞因子IL-2、IL-6、IL-1β和TNF-α显著升高，经口给予RES使上述细胞因子水平呈不同程度的下降，其中IL-2和IL-6下降显著。辅助性T细胞(Helper T cell, Th细胞)可分化为Th1、Th2、Th3和Th17细胞亚群，其中Th1细胞为CD4阳性细胞，主要分泌IL-2、TNF-β和IFN-γ等，参与调节细胞免疫，介导细胞免疫应答等。Th2主要分泌TNF-α、IL-6、GM-CSF、IL-3、IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等因子，主要参与体液免疫，在诱发过敏反应中起着决定性的作用(Singh et al., 1999) [23] 。因此，在本研究中，RES可能通过调节部分Th1/Th2细胞因子减少NAFLD发展过程中的炎症反应。
5. 结论
由实验结果得知，通过高脂日粮结合四氯化碳诱导可建立较理想的小鼠NAFLD模型，表现为体重在升高；肝脏及血清中TG、TC、LDL-C的水平升高，HDL-C降低；小鼠肝脏指数和血清转氨酶水平显著升高及血清中细胞因子IL-2、IL-6、IL-1β以及TNF-α升高；小鼠肝脏组织发生明显的脂肪病变。用白藜芦醇预防处理可显著改善高脂所诱导的脂肪病变，并在不同程度上对血脂和肝脂成分、转氨酶以及细胞因子水平起到了调节作用。以上结果揭示，白藜芦醇对小鼠非酒精性脂肪肝有一定的预防作用，其作用机制需进一步研究。
基金项目
“国家自然科学基金”(31772819和31302005)。