1. 引言
齐墩果酸(Oleanolic acid, OA)是具有保肝护肾、抑制血小板凝集、降血脂、降糖、抗癌、抗应激、抗微生物等作用的一类五环三萜类化合物 [1] [2] 。前期课题组抗糖尿病药物研究中发现将齐墩果酸双键还原的衍生物二氢齐墩果酸,具有较强的促葡萄糖消耗活性,是一个值得开展深入研究的化合物。在化合物开发的过程中,所测定的血浆稳定性以及血浆蛋白结合率是前期研究基础,药物吸收入血后只有游离型的药物能从血液进入作用部位发挥药理作用,而结合型的药物则无药理活性,游离型药物的浓度与药物的药效学、毒理学过程密切相关 [3] [4] [5] 。本实验采用超滤法测定二氢齐墩果酸与大鼠血浆中的蛋白结合率 [6] [7] [8] ,为二氢齐墩果酸的有效应用及测试方法的研究提供一定的理论依据。对于处于开发阶段的化合物二氢齐墩果酸,及早地预测和评估血浆稳定性以及血浆蛋白结合是有一定现实意义的 [9] [10] 。
2. 材料
2.1. 仪器
高效液相色谱仪(型号Waters e2695,美国沃特世公司);漩涡混合器(型号XH-B,江苏康健医疗用品有限公司);氮气吹扫仪(型号JN300-2,苏州吉米诺仪器有限公司)高速离心机(GENESPEED型号X1, Gene Company Limited)超声波清洗器(型号KH-600E,昆山禾创超声仪器有限公司);十万分之一电子天平(型号FA805N,上海菁海仪器有限公司)超低温保存箱(型号:DW-86L486, Haier)。
2.2. 药品与试剂
二氢齐墩果酸(贵州医科大学药物化学重点实验室制备,经高效液相色谱鉴定纯度大于98%);乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)均购自德国Merck公司;水为屈臣氏超纯水 [11] 。
2.3. 动物
清洁级SD大鼠6只,♂,体质量200~250 g,鼠龄:12~14周,大鼠购自重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司,合格证号:SCXK(渝)2012-0011 [11] 。
3. 方法与结果
3.1. 色谱条件
色谱柱:Waters Symmetry C18 (4.6 mm × 150 mm, 5 μm)柱;保护柱:Waters Symmetry C18 (5 μm Van Guard Cartidge 3.9 mm × 5 mm) [11] ;流速1 ml/min;波长:210 nm;柱温:40℃;流动相:甲醇(A)-0.1%甲酸水(B)等度洗脱(A: 90, B: 10),采集时间:25 min。此高效液相色谱条件下采集样品时如图1所示二氢齐墩果酸与血浆空白基质分开,分离性良好,二氢齐墩果酸出峰时间为11.79 min。
3.2. 对照品储备液的配制
精密称取10.0 mg二氢齐墩果酸对照品以甲醇溶解并定容至5 ml,制备成质量浓度为2 mg/ml的二氢齐墩果酸对照品贮备液,4℃贮藏。
3.3. 样品预处理
3.3.1. 血浆采集
取清洁级SD雄性大鼠6只股动脉采血分别置于以肝素钠溶液涂抹过的离心管中,3000 *g离心10 min离心温度4℃,取上层血浆−80℃冷冻保存。
(A)(B)
Figure 1. (A) Blank plasma; (B) Blank plasma with dihydro oleanolic acid
图1. (A) 空白血浆;(B) 空白血浆与二氢齐墩果酸
3.3.2. 血浆样品处理 [11]
取100 μl血浆样品,加入400 μl甲醇,涡旋混合5 min,12,000 *g离心10 min离心温度4℃,吸取上层有机层,氮气吹干,残渣加入100 μl甲醇溶解,12,000 *g离心10 min离心温度4℃,取上层清液待测。
3.4. 标准曲线的制备
在空白血浆加入二氢齐墩果酸对照储备液,配制成1、2、5、10、20、40 μg/ml的系列溶液,按“血浆样品处理”方法操作。以样品质量浓度为横坐标(X),样品峰面积比值为纵坐标(Y),用加权最小二乘法加权进行回归计算 [11] ,权重系数为(1/X),得线性回归方程Y = 2382.6X + 593.32 (r2 = 0.9988)。结果表明在测定范围内,线性关系良好。
3.5. 精密度试验
制备高中低3个不同浓度的二氢齐墩果酸对照品血浆溶液(其中含二氢齐墩果酸质量浓度分别为2、10、20 μg/ml),按“2.3.1”项下方法处理后,同日内进样5次以测定日内精密度,连续进样3 d以测定日间精密度 [11] 。结果表明,结果表明,低、中、高质量浓度的血浆样品的日内RSD分别为6.34%、4.03%、5.72%,日间RSD分别为6.68%、4.5%、8.23%。
3.6. 血浆稳定性试验
向EP管中加入大鼠空白血浆100 μl,分别加入质控样品工作液1 μl使二氢齐墩果酸质量浓度分别为5、10和20 μg/ml (重复3份,含醇量为1%),振荡混合后在室温下放置0、15、30、60、120、180 min,加甲醇终止反应,按“血浆样品处理”项处理后进行HPLC分析,用随行标准曲线计算相应的药物浓度 [11] 。二氢齐墩果酸低、中、高三个浓度在SD大鼠血浆中百分剩余率均不低于80%,表明稳定性良好,结果如图2。
Figure 2. Stability of dihydro oleanolic acid in rat plasma
图2. 二氢齐墩果酸在大鼠血浆中的稳定性
Table 1. The protein binding rates of 3 kinds of dihydro oleanolic acid in specie of plasma (n = 5)
表1. 3种质量浓度二氢齐墩果酸在大鼠血浆中的蛋白结合率(n = 5)
3.7. 血浆蛋白结合率试验 [11]
取SD大鼠血浆分别加入适量二氢齐墩果酸对照品溶液,涡旋混匀,制备成质量浓度为5,10,20 μg/ml的二氢齐墩果酸血浆样品,在恒温振荡器中37℃温育30 min。将500 μl血浆样品装入Millipore 10 K超滤管中,2000 *g离心25 min制备超滤液,测定游离的二氢齐墩果酸含量,离心过程控制温度在4℃条件下。另外吸取100 μl的二氢齐墩果酸血浆样品,按“2.4”项下方法前处理血浆样品液和超滤液,按上述色谱条件进样测定,记录色谱图,测定其中药物总量。计算血浆样品液和超滤液中二氢齐墩果酸的含量:总浓度为Dt,游离浓度Df,蛋白结合率(%) = [(Dt − Df)/Dt] × 100% [11] 。二氢齐墩果酸低、中、高三个浓度在SD大鼠血浆中的蛋白结合率处于中等水平(72.86%~77.31%)。二氢齐墩果酸在大鼠血浆中的蛋白结合率见表1。
4. 讨论
通过在体外与血浆一起孵化,能够快速确定一种化合物在血浆中是否易降解及其降解程度。本试验确定了二氢齐墩果酸在血浆中稳定性良好,保证了该化合物在进入血液循环后的稳定性。测定快速是超滤法的优点,通常几十分钟即可收集到足够供测定的血浆超滤液。理论上,高血浆蛋白结合率的药物临床使用容易产生安全性问题。而本研究显示二氢齐墩果酸的血浆蛋白结合率不超过80%,说明其由于血浆白结合率改变而导致游离浓度急剧升高所产生不良反应的可能性不大。
基金项目
贵州省普通高等学校药物化学工程研究中心建设项目(黔教合KY字[2014]219);贵州省化学合成药物研发利用工程技术研究中心项目(黔科合[2016]平台人才5402);贵州省联合基金项目(黔科合LH字[2015]7340、[2016]7379);贵州省科技支撑计划(黔科合支撑[2017]2839)。
参考文献
NOTES
*通讯作者。