1. 引言
油樟(Cinnamomum longepaniculatum (Gamble) N. Chao)，系樟科樟属，是我国独有的珍贵树种 [1]。油樟主要产自四川宜宾，在湖北、湖南、陕西、云南、江西、广西、广东等地均有分布 [2] ，我国每年的油樟精油产量达世界总产量的46% [1]。油樟的药理作用十分丰富，其中所含黄酮类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抗癌、镇痛、护肝、抗菌、抗病毒、防止动脉硬化、抗自由基 [3] 和抗油脂氧化 [4] 等作用；油樟叶多糖具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抗病毒、降血脂、抗氧化的作用及清除自由基的能力 [5] ；研究表明油樟叶提取物具有抗炎活性，对足底福尔马林诱导的化学伤害和醋酸引起的小鼠腹腔毛细血管通透性增加都有抑制效果 [6]。且肝癌BEL-7402细胞具有体外抗肝癌细胞活性 [2]。油樟精油是一种植物源天然活性物质，具有抗氧化活性，清除体内自由基，且对人体副作用少、毒性小、不易产生耐药性，对高效低毒的天然抗氧化剂及低副作用的天然抗炎活性成分的研发有重要意义 [1]。在人体内，当电子流变成非耦合(出现未配对单电子)时就会产生自由基 [7] ，自由基对人类有着双重影响，在生命系统中扮演着双重角色。如ROS自由基含量对人类的有氧代谢影响显著，过高的含量会破坏细胞的大分子结构，DNA、蛋白质和脂质 [8] [9]。因此，人体内自由基的存在与人类一系列慢性疾病的产生息息相关，如癌症、糖尿病、神经退行性疾病、心血管疾病和炎症 [10] - [15]。
红外光谱技术是一种基于分子内部原子间的相对振动和分子转动等信息来确定物质分子结构和鉴别化合物的分析方法 [16]。该技术具有快速、无损、样品处理简单，无需试剂消耗等特点 [17] ，在天然产物及中药分析鉴定方面已得到了广泛的应用，因此本研究采用近红外技术对油樟精油清除自由基的抗氧化类型进行分析 [16] [17]。
传统的精油提取方法有水中蒸馏法 [18] ，水上蒸馏法 [19] ，水蒸气蒸馏法 [18] ，超临界流体萃取法 [18]。水中蒸馏法是提取精油的传统方法，其优点是设备便宜、操作简单，但耗时较长，且由于高温或水解作用而使精油品质不高 [18] ；水上蒸馏法蒸馏速度较快，所得精油品质较好，缺点是不能提出全部精油，适用于细胞壁较薄的植物原料的提取 [19]。水蒸气蒸馏法的优势在于可控的蒸汽量避免了精油与水的长时间接触，从而提高精油的品质，但其设备较复杂，且难以保证提取效率 [18] ；超临界流体萃取法是提取精油的绿色技术，其较低的操作温度避免了精油中热敏性成分的破坏，最大程度上保证了精油原有的香气，但该技术对设备要求较高，费用昂贵 [18]。无溶剂微波萃取法的原理是利用植物原料中的原位水变成水蒸气破坏细胞壁，并和精油一起馏出分离得到精油，该方法减少了水的消耗，降低了能耗，后续分离也较容易，近年来已被应用于萃取精油 [18] [19]。
本实验以无溶剂微波萃取法和水蒸气蒸馏法所得的油樟挥发油为研究对象，用GC-MS分析精油化学成分，并且通过DPPH自由基和ABTS自由基的清除实验研究其抗氧化活性，以及近红外的方法对油樟挥发油的抗氧化能力进行分析，为油樟精油药用价值的开发利用提供数据支持。
2. 实验
2.1. 材料与仪器
油樟叶资源采自四川宜宾，油樟叶经振荡筛清理除杂，粉碎后(40目)作为挥发油的提取原料。
气质联机采用Agilent 6890N-5973型气相质谱联用仪(Agilent Technologies，美国)，HP-5MS 5% Phenyl Methyl Si-loxane弹性石英毛细管柱(30 m × 0. 25 mm × 0. 25 μm)；升温程序为柱温60℃，保持5 min后；以4℃/min速率升温至120℃，保持5 min；再以3℃/min速率升温至170℃，保持2 min；以10℃/min速率升温至280℃，保持5 min；汽化室温度230℃；载气为高纯He (99.999%)；柱前压43 kPa；载气(He)体积流量1.6 mL/min；进样量1.0 μL，不分流；溶剂延迟时间4.0 min。电子轰击(EI)离子源，能量70 eV；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；接口温度280℃；质量扫描范围m/z 40~400，化学组成的比对应用NIST11质谱库。红外光谱仪采用傅立叶变换红外光谱仪(Thermo Scientific Nicolet iS10，美国)。
2.2. 实验方法
2.2.1. 油樟叶含水率的测定
精密称取油樟叶粉末1.00 g (三份)，放入105℃ ± 3℃的烘箱干燥至恒重，计算含水率为8.90%。
2.2.2. 油樟叶饱和含水率的测定
精密称取油樟叶粉末1.00 g (三份)，在蒸馏水中浸泡12 h后，减压抽滤除去多余水分，计算饱和含水率为96.97%。
2.2.3. 水中蒸馏法萃取油樟精油(HD)
将油樟叶粉末20.0 g放入圆底烧瓶中，加入500 mL蒸馏水，电热套加热进行水中蒸馏2 h，电热套的功率为500 W，萃取完成后收集精油提取器中的精油，−20℃冷冻保存。
2.2.4. 无溶剂微波法萃取油樟精油(SFME)
微波提取系统由微波辅助萃取仪(XH300A，北京祥鹄科技发展有限公司)，一个多段工作模式的反应器和一个温度红外传感器组成。精密称取50.0 g风干样品先用500 mL水室温浸泡12 h，然后排出多余的水分，转移至圆底烧瓶中，放入微波辅助萃取仪，上接精油提取器收集蒸馏出的精油。
2.2.5. 单因素分析
精密称取50.0 g风干样品先用500 mL水浸泡12 h，然后排出多余的水分，转移至圆底烧瓶中，放入微波辅助萃取仪，将微波反应器的功率设置为700 W，每隔2.0 min记录一次精油体积。
精密称取50.0 g风干样品先用500 mL水浸泡12 h，然后排出多余的水分，转移至圆底烧瓶中，放入微波辅助萃取仪，将微波反应时间设置为25 min，微波功率分别为500 W、600 W、700 W、800 W、900 W，记录精油体积。萃取完成后收集油樟精油，−20˚C冷冻保存。
2.2.6. 抗氧化能力测定
1) 清除DPPH阴离子自由基(DPPH−)能力测定
DPPH即1,1-二苯基-3-硝基苯肼,是一种很稳定的氮中心的自由基。DPPH检测法的原理是通过DPPH分子中一个稳定的自由基与抗氧化剂提供的一个电子配对结合，生成无色产物，使溶液的典型紫色变浅 [18]。用无水乙醇配制浓度为0.00%、10%、20%、30%、40%、50%的精油样品和380 mg/L的DPPH−溶液，取0.1 mL不同浓度样品与3.9 mL DPPH−溶液混合，在黑暗处放置30 min后，在517 nm处测定吸光值，浓度为0.00%的样品的吸光值为A对照，所有吸光值均测定三次，取平均值。DPPH−溶液吸光值与浓度有很好的线性关系，吸光值可以反映其浓度的变化，因此可以用来测定油樟精油的抗氧化能力 [20]。
2) 清除ABTS阳离子自由基(ABTS+)能力测定
精密称取ABTS0.0406 g和过硫酸钾0.0070 g，分别用去离子水定容到10 mL，等量混合两种溶液，在室温黑暗条件下反应12 h。取1 mL溶液，在744 nm处获得用甲醇稀释29倍的ABTS+溶液的吸光值。分别取0.150 mL浓度为0.00%、1%、2%、3%、4%和5%的精油样品与2.850 mL的ABTS+溶液混合，在室温黑暗条件下放置2 h，测定吸光值，所有吸光值均测定三次，取平均值。
2.2.7. 近红外光谱数据的采集
对上述样本进行光谱采集，考虑到空气中杂质的影响，在光谱扫描之前先进性杂质的剔除。光谱扫描的波数范围为400~4000 cm−1，样本数为12，每个样品测试3次取平均值。
3. 结果与分析
3.1. 无溶剂微波法
3.1.1. 微波反应动力学
在700 W的微波功率下获得精油的萃取动力学曲线，如图1(a)所示。随着萃取时间的增加，精油的提取量迅速增加。25 min内，精油的萃取量不断增加；25 min后，精油体积不再变化。因此，选择25 min为最佳提取时间。
3.1.2. 最佳微波功率的确定
为探究微波功率对精油提取量的影响，分别在500 W、600 W、700 W、800 W、900 W的微波功率下进行25 min的微波萃取。获得萃取精油的体积随微波功率的变化数据如图1(b)所示。当微波功率小于700 W时，精油体积随微波功率的增加而增加；大于700 W时，所得精油体积略有下降。因此，考虑到提取率高、能耗低要求，选取700 W为最佳微波功率。
3.2. 油樟精油的化学组成分析
将油樟精油通过气质联用法分析其化学组成，挥发性成分的组成及相对含量详见图2。
由图2可知，油樟挥发性成分由烯烃、醇类和少量的酯类化合物组成。用无溶剂微波法和传统水蒸馏法获得的精油中成分种类相同，主要成分相同，但含量稍有差异。无溶剂微波法获得的精油中，含量最高的桉叶油醇，相对含量为67.07%；其次是α-松油醇，相对含量为11.33%；桧烯含量也较高，相对含量为10.98%。传统水蒸馏法获得的精油中，成分含量最高的也是桉叶油醇，相对含量为53.84%，其次是α-松油醇，相对含量为14.89%，桧烯含量也较高，相对含量为10.48%。
3.3. 油樟精油抗氧化能力测试
自由基清除率用SC%表示，SC% = (1 − A样品/A对照) × 100%，其中A样品为样品溶液在固定波长下的吸光值，A对照为不加样品的溶液在t = 0处的吸光值。
3.3.1. 精油清除DPPH阴离子自由基能力
测定新配的不加精油样品的DPPH−溶液在517 nm处的吸光值，此吸光度值是最大吸光度值，为1.244。待精油样品与DPPH−溶液反应30 min后，在517 nm处测得各样品的吸光度值，不同浓度的精油对DPPH−的清除率如图3(a)所示。DPPH−溶液浓度为0.0038 g/100 mL，空白对照组吸光值0.715。
由图3(a)可知，10%浓度的精油对DPPH−的清除率为54.80%，50%浓度的精油对DPPH−的清除率为96.50%，随着精油浓度的提高，对DPPH−的清除率也逐渐提高。可见油樟精油对DPPH−的抗氧化活性很高。体积浓度为10%的精油对DPPH−的清除率即可达到50%。
3.3.2. 精油清除ABTS阳离子自由基能力
新配置的ABTS+溶液在744 nm处取得最大吸光度值为1.095，空白对照组吸光度值为1.095。不同浓度的精油对ABTS+的清除率随精油浓度的变化曲线如图3(b)所示。1%浓度的精油对ABTS+的清除率为40.09%，5%浓度的精油对ABTS+的清除率为96.35%，可见较低浓度的精油对ABTS+有较高的清除率。而且随着精油浓度的提高，对ABTS+的清除率也逐渐提高。
3.4. 近红外光谱分析油樟精油的抗氧化性
光谱的采集仪器为红外光谱仪采用傅立叶变换红外光谱仪(Thermo Fisher Scientific，美国)，每个样品连续扫描三次。由于空气中有CO2，先进行基线校准扣除CO2背景，从而更为细致地反映光谱特征。选
(a) (b)
Figure 1. Extraction kinetic curve for essential oil (a); Effect of microwave power on essential oil yield (b)
图1. 微波反应动力学(a)；微波功率对精油得率的影响(b)
Figure 2. Chemical composition of essential oil from Cinnamomum longepaniculatum
图2. 油樟挥发油主要组成化合物
(a) (b)
Figure 3. Clearance rate for DPPH free radicals (a); Clearance rate for ABTS free radicals (b)
图3. DPPH阴离子自由基清除率(a); ABTS阳离子自由基清除率(b)
取用近红外技术对加入精油样品的DPPH和ABTS溶液进行光谱分析，根据数据特点，选取波数80~2500 cm−1范围内的数据作图，用主成分分析技术剔除异常光谱，对光谱进行优化。
图4(a)和图5(a)为DPPH和ABTS样品的NITS连续扫描光谱图，图4(b)和图5(b)是红外数据的二阶
(a) (b)
Figure 4. Original spectra of samples (a); Second derivative spectra of samples (b)
图4. DPPH样品连续扫描光谱图(a)；光谱二阶微分图(b)
(a) (b)
Figure 5. Original spectra of samples (a); Second derivative spectra of samples (b)
图5. ABTS样品连续扫描光谱图(a)；光谱二阶微分图(b)
导数光谱图，红外光谱进行二阶求导后，各波长下的吸收峰更加明显，且能够显示微小的变化。图4中，在波数1100和1050 cm−1处有两个醇的吸收峰，在波数870 cm−1附近有一个烯烃的吸收峰，含不同浓度精油的DPPH·—溶液的二阶导数图有着相似的形状，说明不同浓度的油樟精油对DPPH·—有相同的抗氧化类型；图5中，在波数1050 cm−1附近有一个醇的吸收峰，含不同浓度精油的ABTS+溶液的二阶导数图有着相似的形状，说明不同浓度的油樟精油对ABTS+也具有相同的抗氧化类型。图4(b)和图5(b)对比可知，峰的位置和强度不同，光谱的形状不同，可见油樟精油对DPPH·—和ABTS+有着不同的抗氧化类型。
4. 结论
本研究采用无溶剂微波辅助萃取法和传统水蒸馏法获得油樟精油。通过单因素试验探究了无溶剂微波萃取法的最优条件。所得油樟精油萃取量为2.2 mL/100 g原料，水蒸气蒸馏法获得油樟精油的产量为1.6 mL/100 g，SFME法比HD法有更高的精油提取率。通过单因素分析法确定SFME的最佳萃取条件为微波功率700 W，微波处理时间25 min。用GC-MS分析SFME和HD萃取的油樟挥发油的化学成分，油樟挥发性成分由烯烃和醇类化合物和少量的酯类化合物组成。用无溶剂微波法和传统水蒸馏法获得的精油中成分种类相同，主要成分相同，但含量稍有差异。无溶剂微波法获得的精油中，含量最高的桉叶油醇，相对含量为67.07%；其次是α-松油醇，相对含量为11.33%；桧烯含量也较高，为10.98%。传统水蒸馏法获得的精油中，成分含量最高的也是桉叶油醇，含量为53.84%，其次是α-松油醇，含量为14.89%，桧烯含量也较高，为10.48%。在DPPH、ABTS自由基清除实验中，50%浓度的精油样品对DPPH阴离子自由基的清除率为96.50%，5%浓度的精油样品对ABTS阳离子自由基的清除率为96.35%。可见油樟精油对两种自由基具有较高的清除率，且对ABTS的清除能力远高于DPPH。用近红外技术对样品进行光谱分析来探究油樟精油的抗氧化类型，为今后的对油樟挥发油的研究提供数据支持。
基金项目
作者感谢中央高校基本科研业务费专项资金项目(2572016BB01)和东北林业大学大学生创新训练项目(201710225018)的资助。