1. 引言
胆管癌是肝胆外科常见的一种病死率极高的高度侵袭性恶性肿瘤，且近年来，其发病率及死亡率呈逐年升高的趋势 [1] 。胆管癌起源于胆管上皮细胞，因起病隐匿，进展迅速，早期诊断困难，对常规放射治疗和化疗不敏感，手术切除率低，术后复发率高，故临床上大多数胆管癌患者在确诊时已处晚期从而失去进行根治性手术的机会 [2] 。因此，临床上迫切需要找寻一种新的强有力的评估胆管癌发生发展的分子标志物以期达到判断患者预后及进行肿瘤靶向治疗的目的以提高患者生存质量或术后生存期。
MicroRNA (微小RNA, miRNA)是一种包含大小约为21~25个核苷酸的非编码小分子RNA，它广泛参与各种病理和生理过程的调节，在细胞的增值、凋亡、分化、个体发育等方面发挥着巨大作用，且与肿瘤的发生和发展密切相关 [3] 。近年来多项研究结果表明：多种MicroRNA在胆管癌中异常表达并起到癌基因或抑癌基因的作用 [4] 。miR-224作为microRNA的一种亚型，已有研究发现其在多种恶性肿瘤中存在异常表达并参与肿瘤的发生发展 [5] 。但关于其在胆管癌中的表达及与患者临床病理学意义，目前尚未见报道。因此，本研究通过探讨miR-224在胆管癌组织和癌旁组织中的表达差异及其临床病理学意义，以期为胆管癌预后判断提供新思路，为其精准医疗提供新靶标。
2.资料与方法
2.1. 一般资料
2.1.1. 研究对象
选取青岛大学附属烟台毓璜顶医院肝胆胰外科2015年09月至2017年10月实施手术治疗的远端胆管癌患者组织标本30例，患者年龄分布为58~73岁，平均年龄65.30 ± 4.324岁，男女比例3:2。所有入选患者此前均未接受过放、化疗，临床病理资料完整，且均为经病理组织学确诊的初诊初治患者。纳入患者中术后病理提示中低分化者10例，高分化者20例，其中标记淋巴结阳性者16例，阴性14例，所有患者均按照美国癌症联合委员会(AJCC)的第8版远端胆管癌分期系统 [6] 进行TNM分期：0期即TisN0M0，I期即T1N0M0，II期即T1N1M0、T2N0M0、T2N1M0、T3N0-1M0，III期即T1-3N2M0、T4任何NM0，IV期任何T任何NM1 (Tis表示原位癌，T1指侵及胆管深度小于5 mm，T2、T3分别表示侵及深度为5~12 mm、大于12 mm，T4表示肿瘤侵及腹腔动脉干、肠系膜上动脉和/或肝总动脉；N0表示无区域淋巴结转移，N1、N2分别指1~3枚、大于或等于4枚区域淋巴结转移；M0表示无远处转移，M1指有远处转移)。所选患者中I期、II期21例，III期、IV期9例，这其中有23例患者行传统的胰十二指肠切除术，1例患者行保留幽门的胰十二指肠切除术，2例行胆管–空肠吻合术，3例行姑息性肿瘤局部切除加胆肠内引流术，1例行剖腹探查加T型管引流术。入选患者及家属术前均签署知情同意书，同意使用其术后组织标本用于本次科学研究，且通过医院医学伦理委员会批准。
2.1.2. 实验试剂和仪器
Trizol试剂液购自上海普飞生物科技有限公司；逆转录引物及microRNA PCR引物均购自广州锐博生物科技有限公司，逆转录酶试剂盒购自美国promega公司。主要仪器有：FLUKO公司F6/10超速匀浆机，Thermo公司Nanodrop2000/2000C分光光度计，瑞士Roche公司LightCycler480 Real time PCR仪。
2.2. 实验方法
2.2.1. 总RNA抽提
将待研磨的组织样品−80˚C冰箱中取出，无菌刀片于干冰上将组织样品切割成约3 mm × 3 mm × 3 mm大小，置于装有1 mL Trizol裂解液的EP管中。用超细匀浆机进行组织研磨；研磨后4˚C，5000 rpm离心3 min，弃沉淀，吸取上清液至新EP管中；每管加入200 μL氯仿，用手上下颠倒EP管15 s，室温静置10 min；于4˚C、12,800 rpm离心15 min后吸取上层液体至新EP管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4˚C静置10 min；于4˚C、12,800 rpm离心12 min后弃上清后加入1 mL、75%乙醇(用DEPC水新鲜配制)，洗涤沉淀；然后于4˚C、11,800 rpm离心5 min，弃去大部分上清后再次于4˚C、11,800 rpm离心5 min，弃去上清，室温下干燥；待RNA沉淀基本透明时，加入RNase-free水至完全溶解，用分光光度计分析测定所抽提RNA的浓度及质量。所抽提的总RNA置于−80˚C下保存。
2.2.2. 逆转录获取cDNA
每1 nmol引物加入RNase-free水200 μL,涡旋振荡充分溶解后瞬时离心，配成终浓度为5 μM的引物储存液。取5 μM的RT引物储存液1 μL，加入79 μL的RNase-free水配制成62.5 nM的RT引物工作液；PCR引物按照5 μM的浓度使用。将2 μL逆转录引物(0.5 μg/μL)和2.0 μg总RNA加入到PCR小管中，补RNase-Free水至11 μL；混匀后离心，70˚C温浴10 min；之后立即置于冰水混合物中冰浴，使逆转录引物和模板退火。在上述混合物中按以下比例：5 × RT buffer 5 μL、10 mM dNTPs 2 μL、Rnasin 0.4 μL、M-MLV-Rtase 1 μL、RNase-Free水2.6 μL，在冰浴中进行反应体系(25 μL体系)配制，混匀，短暂离心。上述体系在42˚C水浴反应1 h，然后在70˚C水浴10 min使RT酶失活，将得到的RT产物-cDNA置于−20˚C保存备用。
2.2.3. RT-PCR检测
按下列比例配置反应体系(12 μL体系)：SYBR premix ex taq6.0 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、模板1.0 μL、RNase-Free水4.0 μL；RNA PCR 12 μL反应体系：SYBR premix ex taq6.0 μL、引物mix0.3 μL、模板0.6 μL、RNase-Free水5.1 μL。两步法进行Real-Time PCR，并制作熔解曲线。
MiR-224-5p RT引物序列：
5,-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAACGGAAC-3,，
上游引物序列：5,-ACACTCCAGCTGGGCAAGTCACTAGTGGTTCCGTT-3,，
下游引物序列：5,-TGGTGTCGTGGAGTCG-3,；
U6：
上游引物序列：5,-CTCGCTTCGGCAGCACA-3,，
下游引物序列：5,-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3,。
U6用作内参，倍数变化计算采用2−ΔCt法进行分析来表示miRNA-224的表达水平。
2.3. 统计学方法
采用软件GraphPad Prism 6.0进行数据分析，胆管癌患者癌组织与癌旁组织中miR-224表达差异的比较、胆管癌组织中miR-224相对表达量与胆管癌患者临床病理特征之间的关系用X2检验。P < 0.05认为差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1. miR-224-5p和内参U6引物的检测
miR-224-5P和U6在部分胆管癌组织中的扩增曲线如图1(a)所示，miR-224-5P和U6的溶解曲线(如图1(b)和图1(c))均为单峰，提示miR-224-5P和U6的产物均为单一产物。
3.2. miR-224-5p在胆管癌组织与癌旁组织中的表达水平
RT-PCR的结果显示，胆管癌组织中的miR-224-5p的相对表达量为(10.23 ± 0.8861)，癌旁组织中的相对表达量为(0.4734 ± 0.04018)。胆管癌组织中miR-224-5p的表达水平明显高于癌旁组织中的表达水平。P < 0.0001，提示两者之间的差异具有统计学意义(图2，将2−ΔCt扩大106倍作图)。
3.3. miR-224-5p的表达与胆管癌患者临床病理学特征的关系
根据RT-PCR结果，分析胆管癌组织中miR-224-5p的表达与胆管癌患者临床病理特征(年龄、性别、分化程度、有无淋巴结转移、病理分期)的关系，显示胆管癌组织中miR-224-5p的表达水平与患者有无淋巴结转移密切有显著相关性，有淋巴结转移的患者癌组织中的miR-224-5p的相对表达量明显高于无淋巴结转移的患者(P < 0.05)；另外，发现miR-224-5p的表达水平与患者的TNM病理分期密切相关，III期与IV期胆管癌患者癌组织中miR-224-5p的相对表达量明显高于I期与II期患者(P < 0.05)。胆管癌组织中miR-224-5p的相对表达量与其他患者年龄、性别以及肿瘤的分化程度等临床病理因素无显著相关关系(P > 0.05) (详见表1，2−ΔCt扩大106倍进行数据分析)。
4. 讨论
近年来，microRNAs在肿瘤领域的研究越来越宽泛，越来越深入。miRNAs通过碱基配对原则与靶mRNA的3’端互补结合，参与转录后的基因调控，其表达失控与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关，具有广泛的生物学效应 [7] 。在肿瘤组织中存在与正常组织不同的具有特征性的microRNA表达谱，而这些microRNA在肿瘤患者中的表达变化均可以通过实验室测定。因此，MicroRNAs可能成为肿瘤诊断和监测疾病进展的新的分子标志以及判断肿瘤预后的分子靶点，将有助于肿瘤诊治 [8] 。
有研究表明，许多miRNA在肿瘤中被发现存在异常表达的现象，其中miR-224颇受关注。miR-224作为microRNA家族其中的一员，研究发现其在肝癌 [9] 、胃癌 [10] 、结直肠癌 [11] 、胰腺癌 [12] 、弥漫性大B细胞淋巴瘤 [13] 、前列腺癌 [14] 、乳腺癌 [15] 、宫颈癌 [16] 、非小细胞肺癌 [17] 等人类肿瘤中均
注：(a) microRNA-224-5p与内参U6的扩增曲线；(b) U6的溶解曲线；(c) microRNA-224-5pa的溶解曲线。
Figure 1. Detection of micro-224-5p and U6 primers
图1. micro-224-5p和U6引物的检测
Figure 2. Relative expression of miR-224-5p in cholangiocarcinoma and adjacent tissues
图2. 胆管癌组织与癌旁组织中miR-224-5p的相对表达量
Table 1. Comparison of miR-224-5p expression levels in cancerous tissues of patients with cholangiocarcinoma with different clinicopathological features
表1. 不同临床病理特征的胆管癌患者癌组织中miR-224-5p表达水平的比较
存在较为显著的异常表达并且以癌基因或者抑癌基因的身份发挥作用，通过测定其表达变化可能成为一种对恶性肿瘤进行早期诊断和判断预后的新的重要手段。本研究通过选取手术切除的胆管癌癌组织及癌旁组织，利用RT-PCR技术检测患者癌组织及癌旁组织中miR-224的相对表达量，结果发现与癌旁组织相比，miR-224在癌组织中的表达水平显著上调，提示miR-224在胆管癌中起到潜在癌基因的作用。结合患者的临床病理资料，运用统计学方法分析miR-224的表达与患者临床病理特征之间的关系，结果显示：miR-224的表达水平与患者的年龄、性别以及肿瘤的分化程度无相关性，但是miR-224在有淋巴结转移患者中的表达水平比在无淋巴结转移患者中的表达显著升高，并且患者TNM病理分期越晚，miR-224的表达水平越高。实验结果提示miR-224的高表达对于胆管癌患者的预后可能起到消极作用。故推测miR-224可能调控着肿瘤的发生发展，迁移与侵袭。测定miR-224的表达量可为胆管癌患者预后的判断提供理论基础和参考，并且为胆管癌的靶向精准治疗提供新靶点。当然，本研究同样存在一些不足，例如所获取的患者病例数较少以及缺少随访等，对于miR-224在胆管癌患者预后中的精确价值无法进一步进行评估。
目前，对microRNA-224的研究还不够深入，本研究对microRNA-224与胆管癌的调控机制及信号通路研究奠定了一定的前期基础。关于microRNA-224调控的特定靶基因以及参与胆管癌生物学功能的详细分子机制，都需要我们进一步完善。
基金项目
山东省自然科学基金项目(ZR2014HM052)资助。