氟喹诺酮酸酯的ESI-MS裂解研究

Study on the ESI-MS Dissociation of Fluoroquinolone Acid Esters

摘要: 氟喹诺酮酸酯对养殖业和人类健康存在潜在危害，发展其分析检测方法具有重要的意义。本论文制备了七种氟喹诺酮酸酯，并在ESI质谱仪的正离子测试模式下，获取它们的MS²裂解图谱。结果显示七种氟喹诺酮酸酯均优先断裂酯基中的C-O键，产生三种高强度的碎片离子峰：[M+H]⁺、[M+2H-Y]⁺和[M-Y-16]⁺ (Y为酯基中烷基的质量数)。这些碎片可以作为定性离子，用于鉴定氟喹诺酮酸酯。

Abstract: Fluoroquinolone acid esters have potential hazards to the breeding industries and human health, so it is of vital significance to develop its analysis and detection methods. In this paper, seven kinds of fluoroquinolone acid esters were prepared. The ESI-MS² dissociation spectrograms of these compounds were obtained under the positive ions test mode of mass spectrometry. The results showed that the C-O bonds of ester groups in these fluoroquinolone acid esters were preferentially fractured. Three fragmentation ion peaks with high intensities were found. It includes [M+H]⁺, [M+2H-Y]⁺, and [M-Y-16]⁺ (Y refers to the mass number of alkyl groups in ester groups). These fragmentation ions could be used as qualitative ions for the identification of fluoroquinolone acid esters.

1. 引言

喹诺酮类药物(Quinolones, QNs)是一类人工合成的抗菌药物，其主要活性结构存在于许多天然物质中 [1] 。通过对母体的修饰，可得到不同功效的喹诺酮类药物，其具有抗菌谱广、抗药活性强和与许多抗菌药物间无交叉耐药性的特点，已被广泛地应用于人类与动物的抗菌治疗中。不仅如此，临床研究表明，喹诺酮类药物还具有一定的抗癌作用 [2] [3] [4] [5] 。但是喹诺酮类药物在预防和治疗的过程中，通常被不规范使用。特别是作为兽药时，被频繁地滥用导致了动物源食品中喹诺酮药物残留超标。人类在食用含喹诺酮类药物残留的食品后，会相继引发体内病菌对喹诺酮类药物的耐药性积累 [6] [7] [8] [9] 。同时，喹诺酮类药物还会引发中枢神经系统的病变，肌腱炎，心律失常等等不良反应 [10] [11] [12] 。喹诺酮类药物的残留无疑给人们的食品安全埋下了隐患。

近年来，动物源食品中喹诺酮类药物残留的检测方法得到了快速的发展 [13] [14] [15] 。在这些方法中，最有应用价值的是基于液相色谱–质谱联用技术同时快速检测多残留有害物质的技术方法，此方法已被广泛地运用于喹诺酮类药物的分析和鉴定中。2015年9月农业部公告第2292号：经评价，认为洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星和诺氟沙星4种原料药的各种盐、酯及其各种制剂可能对养殖业、人体健康造成危害或者存在潜在风险 [16] 。纵观针对喹诺酮类抗生素药残检测的国家标准，我们发现，对于喹诺酮酸酯的鉴定检测方法仍然没有建立。因此，非常有必要建立喹诺酮酸酯的检测方法，进一步发展动物源食品中未知有害喹诺酮类药物残留的检测手段，为动物源食品的安全防控提供技术支持。基于这一目的，在此制备了七种喹诺酮酸酯并进行了ESI质谱裂解研究，总结了它们的质谱裂解规律。

2. 实验内容

2.1. 主要仪器与设备

API 3200型液相色谱串联质谱联用仪(美国AB Sciex公司)，配置电喷雾离子源(ESI源)；N-1200BV-W型旋转蒸发仪(上海爱郎仪器有限公司)；数显智能恒温磁力搅拌器(IKA)。

2.2. 试剂与材料

恩诺沙星、氧氟沙星、氯甲酸丙酯、氯甲酸烯丙酯、三乙烯二胺均购于安耐吉化学公司，纯度为98%；马波沙星、氟甲喹购于东京仁成工业株式会社，纯度 > 97%；1,2-二氯乙烷(纯度99%，成都市科龙化工试剂厂)、三乙胺(纯度99.0%，General-Reagent公司)。

2.3. 氟喹诺酮酸酯的制备

采用本课题组发展的DABCO促进的α-酮酸与氯甲酸酯的脱羧偶联反应合成酮酸酯的技术制备喹诺酮酸酯 [17] 。应用这一方法，我们分别制备了氧氟沙星丙酯、氧氟沙星烯丙酯、恩诺沙星丙酯、恩诺沙星烯丙酯、氟甲喹丙酯和氟甲喹烯丙酯、马波沙星丙酯等七种氟喹诺酮酸酯(图1)。

实验步骤：向10 mL反应管中依次加入氟喹诺酮(0.2 mmol)、氯甲酸酯(0.3 mmol, 1.5 equiv)和DABCO (0.2 mmol, 1 equiv)，用DCE (2 mL)作为溶剂，于80℃的条件下搅拌反应24 h，反应完毕冷却后，将反应混合物粗过滤，浓缩，用V (乙酸乙酯):V (三乙胺) = 19:1的洗脱剂进行柱色谱分离，得到相应的氟喹诺酮酸酯。

2.4. 质谱的测试

实验步骤：称取氟喹诺酮酸酯10 mg，用少量甲醇溶解，稀释定容到10 mL的容量瓶中，配制成1 mg/mL浓度的溶液，冰箱保存备用。然后移取20 μL的标液稀释至10 ppm，通过直接进样进行质谱测试，扫描时间1分钟。

3. 结果与讨论

3.1. 裂解过程

本研究采用ESI-MSⁿ正离子测试模式，对制备得到的七种喹诺酮酸酯的质谱裂解进行了研究。七种氟喹诺酮酸酯在(+)ESI-MS¹条件下，均出现高强度的离子峰[M+H]⁺。因此提取[M+H]⁺离子进行二次裂解，全扫描得到了七种喹诺酮酸酯的二级质谱图(见图2)。研究分析发现，七种喹诺酮酸酯的二级质谱图中均出现了三种主要的中高强度的离子峰，分别为[M+H]⁺，[M-Y+2H]⁺和[M-Y-16]⁺ (Y为酯基中烷基的质量数)。[M+H]⁺为氟喹诺酮酸酯与H⁺结合形成的离子峰。[M-Y+2H]⁺是氟喹诺酮酸酯加H⁺丢失烷基后再加H⁺形成的离子峰，质量数与对应的氟喹诺酮酸与H⁺加合的质量数一致。[M-Y-16]⁺是氟喹诺酮酸酯丢失烷氧基后形成的离子峰(详见表1)。这三种离子中，失去烷氧基的羰基正离子[M-Y-16]⁺的峰强度最大，这说明这些离子中羰基正离子最稳定、保留时间最长；此外，结合相应的氟喹诺酮酸的质谱裂解 [18] [19] [20] ，[M-Y+2H]⁺相当于氟喹诺酮酸与H⁺加合的离子峰。这一离子也会继续裂解失去一分子

Figure 1. Preparation of fluoroquinolones

图1. 氟喹诺酮酸酯的制备

(a) 氧氟沙星丙酯 (b) 氧氟沙星烯丙酯 (c) 恩诺沙星丙酯 (d) 恩诺沙星烯丙酯 (e) 氟甲喹丙酯 (f) 氟甲喹烯丙酯 (g) 马波沙星丙酯

Figure 2. MS² of fluoroquinolones acid esters

图2. 氟喹诺酮酸酯的二级质谱图

Table 1. The fragmentation information of fluoroquinolones acid esters

表1. 氟喹诺酮酸酯的二级质谱碎片离子信息

水，得到[M-Y-16]⁺离子，这就增加了这个离子在单位扫描时间内的浓度。

除了上述三种共性高强度离子峰以外，马波沙星丙酯和氟甲喹丙酯/氟甲喹烯丙酯的二级质谱图中还出现特异性的碎片离子峰。例如，马波沙星丙酯因哌嗪环发生裂解，产生了m/z 72.2 (C₄H₁₀N⁺)特征离子；氟甲喹丙酯/氟甲喹烯丙酯因六元环开裂使相应的碎片离子丢失一分子中性分子C₃H₆ (42Da)产生m/z 220或m/z 202子离子 [18] 。

这里以氧氟沙星丙酯为例，推测氟喹诺酮酸酯的裂解过程(图3)。首先氟喹诺酮酸酯与H⁺加合断裂

Figure 3. The dissociation pathway of ofloxacin propyl ester

图3. 氧氟沙星丙酯的裂解途径

丢失烷基形成喹诺酮酸，然后快速与H⁺加合形成[M-Y+2H]⁺离子，[M-Y+2H]⁺离子继续丢失一分子水得到羰基阳离子[M-Y-16]⁺。此外，氟喹诺酮酸酯与质子氢加合后在能量的轰击下，也会直接丢失烷氧基形成羰基阳离子。

3.2. 质谱碎片信息

如表1所示，列出了氧氟沙星丙酯、氧氟沙星烯丙酯、恩诺沙星丙酯、恩诺沙星烯丙酯、氟甲喹丙酯、氟甲喹烯丙酯、马波沙星丙酯等七种氟喹诺酮酸酯的二级质谱碎片离子信息。列出的特征离子主要是丢失酯基中的烷基和烷氧基的离子信息。表中的DP表示去簇电压，CE表示碰撞能。

4. 结论

氟喹诺酮酸与氯甲酸酯在DABCO的促进下通过脱羧偶联反应可以顺利制备得到氟喹诺酮酸酯。氟喹诺酮酸酯在(+)ESI模式下，易产生[M+H]⁺离子峰。在(+)ESI-MS²中，具有[M+H]⁺、[M+2H-Y]⁺和[M+H-Y-16]⁺ (Y为氟喹诺酮酸酯中烷基的质量数)三种中高强度的特征峰。其中[M-Y-16]⁺羰基阳离子最稳定，峰强度最大。结果表明在ESI正离子模式环境下，较弱的酯键优先断裂形成羰基正离子。此外，[M+2H-Y]⁺也会丢失一分子水形成羰基正离子，因此羰基正离子的峰强度最大。由于酯基中的烷基相对简单，根据丢失的碎片容易推断是何种烷基，这些信息可以作为定性检测喹诺酮酸酯类化合物的依据。这些结果表明喹诺酮酯同系物在ESI中的断裂机制具有相似性。此研究结果可以为氟喹诺酮酸酯的质谱鉴定提供理论依据，该质谱裂解规律对于氟喹诺酮酸酯同系物的质谱分析，快速筛选鉴别，定量分析有很好的参考价值。

基金项目

广东省科技计划项目(No. 2016B020204005)。