CD4⁺T细胞Tim-3分子在急性期过敏性紫癜患儿外周血中的表达及其临床意义

The Expression and Clinical Significance of CD4⁺Tim-3⁺T Cell in Peripheral Blood for Acute Henoch Schonlein Purpura Patients

摘要: 目的：探讨Tim-3在急性期过敏性紫癜(Henoch Schonlein Purpura, HSP)患儿外周血CD4⁺细胞中的表达及其相关临床意义。方法：选取22名HSP急性期患儿及15名健康对照作为研究对象，流式细胞分析术分子检测各组研究对象外周血外周血CD4⁺Tim-3⁺T细胞比例。并分析该比例与相关临床表现的相关性。结果：HSP患儿急性期外周血CD4⁺ Tim-3⁺T细胞比例(3.03% ± 0.69%)下降较对照组(3.74% ± 0.62%)降低，二者比较结果有统计学意义(P < 0.05)。外周血CD4⁺Tim-3⁺T细胞比例与血沉水平呈负相关(r = −0.813, p < 0.05)，与皮疹持续天数(r = −0.063; P > 0.05)、肾损害(r = −0.208; P > 0.05)、ASO (r = −0.057; P > 0.05)、补体C3水平(r = −0.029; P > 0.05)及患儿受损系统的个数(r = 0.166; P > 0.05)无相关性。结论：HSP急性期患儿外周血CD4⁺Tim-3⁺T细胞比例降低。Tim-3通路有可能参与HSP发病，该指标也许可以作为衡量HSP疾病诊断及病情活动的参考指标。

Abstract: Objective: To identify the expression and clinical significance of Tim-3 in CD4⁺ T cells in HSP acute patients. Methods: 22 HSP acute patients and 15 health cases took part in this research. The fre-quencies of CD4⁺Tim-3⁺ T cells in peripheral blood were detected by Flow cytometry. It also ana-lyzed the relationship between CD4⁺Tim-3⁺ T cells and clinical features. Results: The frequencies of CD4⁺Tim-3⁺ T cells were lower in acute HSP patients (3.03% ± 0.69%) than in healthy controls (3.74 ± 0.62%). The frequencies of CD4⁺Tim-3⁺ T cells were negative related with ESR in HSP acute patients (r = −0.813, p < 0.05), but had no correlation with rash duration in days (r = −0.063; P > 0.05), kidney lesions (r = −0.208; P > 0.05), ASO (r = −0.057; P > 0.05), C3 (r = −0.029; P > 0.05) and the numbers with lesion systems (r = 0.166; P > 0.05). Conclusion: The frequencies of CD4⁺Tim-3⁺ T cells in acute HSP acute patients reduced. The passage of Tim-3 maybe involved the onset of HSP.

1. 引言

过敏性紫癜(Henoch Schonlein Purpura, HSP)是儿童时期常见的自身免疫性小血管炎性疾病，我们的前期研究结果表明，Th17细胞功能紊乱可能参与HSP的发病 [1][2]。T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3 (T cell immunoglobulin-and mucin domain-containing molecules, Tim-3)又称HAVcr-2 (hepatitis A vires cell receptor 2)，通过与其配体(Tim-3 ligant, Tim-3L)即半乳糖凝集素-9 (Galectin-9)结合，给T细胞提供一种负性共刺激信号，在免疫性疾病及免疫耐受中发挥重要作用 [3][4]。据此，我们欲观察CD4⁺T细胞Tim-3分子是否参与HSP急性期的发病，并分析其表达与相关临床表现的关系，为有效治疗HSP提供新靶点。

2. 对象与方法

2.1. 对象

选取2012年1月至2014年12月来山东大学第二医院就诊的22例HSP患儿作为研究对象。其中男患儿12例，女患儿10例，年龄范围为1~12岁，平均年龄7.1 ± 2.2岁。选取健康查体儿童为对照组。其中男童8例，女童7例，年龄范围为1~12岁，平均年龄6.9 ± 2.1岁。两组在性别和年龄上的差异无统计学意义(P > 0.05)。所选病例均为首发病例，诊断标准参照1990年美国风湿病协会提出的HSP诊断及分类标准 [5]。并排除6个月内接受其他激素及免疫抑制药物治疗的患儿以及患有其他自身免疫性疾病或者遗传代谢性疾病的患儿。本研究方案经山东大学第二医院伦理委员会批准，并与患儿家长签署知情同意书。

2.2. 材料与方法

2.2.1. 主要试剂

抗人Tim-3单克隆抗体；抗人CD3抗体；抗人CD4抗体、抗人CD8抗体以及PE-IgG，以上试剂购自于美国eBioscience公司。红细胞裂解液购自于联科生物公司。

2.2.2. 方法

采用流式细胞术检测外周血CD4⁺T细胞Tim-3的表达。取病例组与对照组的EDTA抗凝血各100 ul分别放入两个流式管中，加入抗人CD3单克隆抗体、抗人CD4单克隆抗体及抗人Tim-3单克隆抗体；避光放置30 min，加入红细胞裂解液混匀，并避光放置10 min。

每管加入2 ml PBS液，1200 rpm离心10 min (该步骤重复2遍)。弃上清，吸干，600 ul PBS悬浮细胞，上流式细胞仪检测。

2.3. 统计学处理

所有数据用SPSS for Windows 17.0统计软件处理，数据以均数 ± 标准差( $\bar{x}$ ± s)表示，采用Shapiro-Wilk进行数据正态性检验，数据间的两两比较采用Mann-Whitney U检验，变量相关分析采用Pearson相关以及Spearman相关进行。P < 0.05差别有统计学意义。

3. 结果

3.1. 外周血CD4⁺ Tim-3⁺T细胞表达情况

HSP急性期患儿外周血CD4⁺ Tim-3⁺T细胞比例(3.03% ± 0.69%)较健康对照组(3.74% ± 0.62%)下降，二者比较有统计学意义(P < 0.05)，见图1。

3.2. 外周血CD4⁺T细胞表面Tim-3表达的与其他临床指标的相关性

对于HSP急性期患儿，外周血CD4⁺ Tim-3⁺T细胞比例变化与血沉水平呈负相关(r = −0.813, p < 0.05)，见图2。外周血CD4⁺Tim-3⁺T细胞比例变化与皮疹持续天数无相关性(r = −0.063; P > 0.05)。外周血CD4⁺Tim-3⁺T细胞比例变化与ASO (r = −0.057; P > 0.05)、补体C3水平(r = −0.029; P > 0.05)无相关性。外周血CD4⁺Tim-3⁺T细胞比例变化与患儿受损系统的个数(r = 0.166; P > 0.05)无相关性。外周血CD4⁺Tim-3⁺T细胞比例变化与患儿肾损害无相关性(r = −0.208; P > 0.05)。

Figure 1. Circulating CD4⁺Tim-3⁺Tcell frequencies in HSP patients and healthy controls

图1. CD4⁺Tim-3⁺T细胞在HSP急性期患儿与健康对照组中的表达

Figure 2. The correlation of CD4⁺Tim-3⁺ T cells and ESR in acute HSP patients

图2. HSP急性期患儿CD4⁺Tim-3⁺ T细胞表达与血沉水平的相关性

4. 讨论

Tim-3与其配体Galectin-9结合可以负性调节T细胞反应，近年来，诸多报道表明，Tim-3分子的异常表达，参与了自身免疫性疾病及免疫应答 [6]。如Jones RB等曾报道，人类免疫缺陷病毒感染患者急性期外周血Tim-3在CD4⁺T细胞上的表达上调 [7]。王培等发现类风湿性关节炎高活动度患者外周血CD4⁺Tim-3⁺T细胞比例降低 [8]。Tim-3分子的不同表达可能暗示着疾病的不同发病机制以及不同的免疫细胞优势。

HSP是由环境因素及非特异性感染引起的免疫介导的炎症反应，该病的发病机制与细胞免疫和体液免疫均相关。有报道表明HSP的发病是以Th1免疫反应为主，但是也有报道表明在HSP的发病中Th2免疫反应占优势 [9][10][11]。Li YY等报道HSP患者外周血中Th2细胞和Th17细胞的比例较健康对照组增高，Th1细胞和Treg细胞的比例二组比较无显著性差异 [12]。课题组前期研究结果也表明，Th17细胞的比例增高有可能参与了HSP急性期发病 [2]。CD4⁺T细胞主要包括Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞以及Treg细胞。本研究结果显示，HSP急性期患者外周血CD4⁺Tim-3⁺T细胞比例降低，可能也暗示着Tim-3通路调节了相应T细胞的反应，参与了HSP的急性发病。Tim-3主要表达在Th1细胞和Th17细胞表面，Th2细胞表面是否表达Tim-3分子尚不能确定 [8]。Tim-3作为机体免疫调节过程中的重要因子，已被证明参与了多种疾病的发生和发展。相关研究表明，多发性硬化症患者脑脊液中Tim-3的表达降低，同时INF-γ的表达增高，暗示Tim-3对Th1细胞的负反馈调节异常，从而导致INF-γ的分泌增多 [13]。Ying Liu等发现风湿性关节炎患者体内Tim-3在CD4⁺T细胞上的表达上调 [14]。Yuan LP等的研究发现，HSP急性期患儿体内Tim-1 mRNA表达增加，且其表达与IgA的分泌密切相关 [15]。而目前，关于HSP与Tim-3的关系的相关研究较少。基于此，结合前期研究结果，我们推测，Tim-3的低表达，很可能和异常的Th17细胞有关。在疾病发病的过程中，异常的微环境导致了Tim-3在Th17细胞上表达降低，其对Th17细胞的负性调节失控，从而导致 Th17细胞在外周血中比例上升。

除此之外，本研究还关注了Tim-3分子的表达与疾病临床表现和实验室检查的相关性。研究发现，CD4⁺Tim-3⁺T细胞比例与血沉呈负相关，与受累系统个数、肾损伤、ASO水平及C3水平无相关性。血沉是反应体内炎症的相关指标之一，Tim-3分子的表达与之呈负相关，在一定程度上说明Tim-3分子可能参与了机体的炎症反应。虽然本研究显示Tim-3分子的表达与关注的其他临床特点无相关性，也不能完全说明Tim-3分子与疾病的相关临床表现无关，可能与本研究所纳入的样本量过少也有关，需扩大样本量，做进一步的研究。

综上所述，本研究发现HSP急性期患者外周血CD4⁺Tim-3⁺T细胞比例下降，并且该比例与血沉呈负相关。结合本课题的前期研究结果，我们推测，CD4⁺Tim-3⁺T细胞比例下降可能是导致Th17细胞比例异常的原因之一，也在一定程度上说明了，Tim-3分子参与了HSP的免疫紊乱及炎症反应，具体机制需进一步研究证实。

基金项目

山东省自然科学基金资助项目(ZR2013HQ047)。

参考文献

NOTES

^*通讯作者。