1. 引言
石榴汁中含有丰富的抗氧化物质如Vc、VE及多酚类物质等 [1] ，其中多酚类化合物发挥着最重要的作用。徐静 [2] N. P. Seeram [3] 等人的研究表明石榴汁的抗氧化活性要显著高于其他水果汁，并且其抗氧化能力与其中总酚的含量具有一致性。石榴汁的抗氧化能力比葡萄酒，番茄汁等更强；可防止冠心病、高血压，可达到健胃提神，增强食欲，益寿延年，降低动脉粥状硬化，抵抗心脑血管疾病的功效，同时还有解酒作用 [4] 。随着人们对石榴价值认识的深入，石榴产业开始发展 [5] 。近年来石榴除了鲜食之外，也成为果蔬加工原料的新宠。石榴的加工产品一般有石榴汁，浓缩石榴汁，石榴酒等。国内对石榴汁的抗氧化活性与其他果汁进行比较的研究见多。石榴汁也可以作为石榴酒的原料，决定了石榴酒的风味和品质。在石榴汁的制作，加工与贮藏中，外界因素对其品质有着重大的影响。本实验通过温度与pH值的变化对石榴汁生理活性的影响进行研究，提高石榴汁的附加值和满足天然抗氧化剂市场的需求，都具有经济效益和社会效益，希望为鲜石榴汁的进一步加工与贮藏提供参考和思路。
2. 材料和方法
2.1. 材料与试剂
材料与试剂：新鲜石榴购自临汾市尧都区五一路水果店。芦丁标品购于Sigma公司。亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、80%甲醇、没食子酸、邻苯三酚、碳酸钠、70%乙醇、磷酸盐缓冲液、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁和柠檬酸均为国产分析纯。
2.2. 主要仪器
HH-4型数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；JA2603B型电子天平，上海精科天美科学仪器有限公司；pHS25型酸度计，上海仪电科学仪器有限公司；UV-1100型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。
2.3. 试验方法
2.3.1. 不同温度和pH下鲜石榴汁的制备
将新鲜石榴进行清洗，切瓣，榨汁。榨汁后倒入烧杯中，置于室温下自然澄清12 h。取上层清液用四层纱布过滤得到新鲜澄清的石榴汁。取五组20 ml鲜石榴汁，分别放入65℃、72℃、79℃、86℃、92℃水浴锅中恒温加热1 h，按温度由低到高的顺序分别取上层清液置于已编好1、2、3、4、5号的试管中。另取五组20 ml鲜石榴汁，加入适量柠檬酸，分别将鲜石榴汁的pH调至3.4、3.9、4.4、4.9、5.4、5.9，按pH值由低到高的顺序分别取上层清液置于已编好6、7、8、9、10号的试管中。实验中所用的鲜石榴汁pH值为4.1。
2.3.2. 总酚含量的测定
采用Folin-Ciocalteu法 [6] 测定不同处理下石榴汁中总酚含量。建立回归方程：Y = 1.6243X + 0.0372 (R2 = 0.9983)，其中横坐标表示没食子酸标准液质量浓度，纵坐标表示吸光度值。带入方程计算结果。
2.3.3. 总黄酮含量的测定
采用紫外分光光度法 [7] 测定不同处理下石榴中总黄酮含量。建立回归方程：Y = 0.9317X − 0.0159 (R2 = 0.9982)，其中横坐标表示芦丁标准液质量浓度，纵坐标表示吸光度值。带入方程计算结果。
2.3.4. 二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)清除能力的测定
准确称取2.5 mg DPPH·，用无水甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中,得到 DPPH·质量浓度为25 μg/mL的溶液 [8] 。取样液0.1 mL，加入7.8 mL质量浓度为25 μg/mL的DPPH·甲醇溶液，快速混匀后分别于0、5、10、15、25、35、45、55、65、75 min在波长为516 nm下测定其吸光度，直至吸光度相对稳定。绘制色素清除DPPH·的动力学曲线 [9] 。
2.3.5. 还原力的测定
依次加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸盐缓冲溶液、2.5 mL 1%的铁氰化钾和1 mL样液，混匀，于50℃水浴20 min，快速冷却后加入1 mL 10%的三氯乙酸溶液，2.5 mL蒸馏水和1.0 mL 0.1%的三氯化铁溶液，混合均匀，于室温静置反应10 min，在波长为700 nm处测定吸光度，平行测试3次, 以抗坏血酸作标准抗氧化剂 [10] 。
3. 结果与分析
3.1. 不同温度和pH值处理下石榴汁中总酚含量
3.1.1. 不同温度处理下石榴汁中总酚含量
不同温度下的鲜石榴汁中总酚含量测量结果如图1所示。由图1可知在65℃、72℃、79℃、86℃、93℃处理1 h下，当处理温度为65℃时，总酚含量最高，其值为0.214 mg/mL。随着处理温度的升高，总酚含量依次递减。这可能是因为过高的温度改变了酚类物质的结构，使得含量降低。不同温度处理下总酚含量大小排序为：65℃ > 72℃ > 79℃ > 86℃ > 93℃。
3.1.2. 不同pH值处理下石榴汁总酚含量
图2表示不同pH值下样液的总酚含量。由图2得，当pH = 3.9时，鲜石榴汁中总酚含量最高，其值为0.152 mg/mL。并以pH = 3.9为分界点，当pH值大于3.9时，随着处理的pH值升高，总酚含量降
Figure 1. Polyphenol content of different temperature samples
图1. 不同温度下样液的总酚含量
Figure 2. Polyphenol content pf different pH samples
图2. 不同pH值下样液的总酚含量
低；当pH值小于3.9时，随着处理的pH值降低，总酚含量降低。
3.2. 不同温度和pH值处理下石榴汁中黄酮含量
3.2.1. 不同温度处理下石榴汁黄酮含量
图3表示了在不同温度处理下，鲜石榴汁的黄酮含量有较为明显的差异。从图3看出，当处理温度为65℃时，鲜石榴汁黄酮含量最高为0.152 mg/mL。随着温度的升高，鲜石榴汁中的黄酮含量依次下降。
Figure 3. Flavonoids content of different temperature samples
图3. 不同温度下样液黄酮含量
Figure 4. Flavonoids content of different pH samples
图4. 不同pH值下样液黄酮含量
3.2.2. 不同pH值处理下石榴汁黄酮含量
图4表示了不同pH值处理下石榴汁黄酮含量。由图4可知，当pH为3.9时，鲜石榴汁中总酚含量最高，并以pH = 3.9为分界点，随着处理的pH值升高，总酚含量降低；当pH值小于3.9时，随着处理的pH值降低，总酚含量降低。根据郭松年 [11] 等人的研究，石榴汁中花色苷的色泽在pH较低的情况下较稳定，石榴汁的色泽越鲜艳。但可能因为其它黄酮类化合物在过高或过低的pH下遭到破坏，因此并非pH值越低，石榴汁内黄酮含量越高。
3.3. 不同温度和pH值处理下石榴汁DPPH·的清除能力测定
3.3.1. 不同温度处理下石榴汁DPPH·的清除能力测定
图5为不同温度处理下鲜石榴汁清除DPPH·的动力学曲线。由图5对比可得：体系的吸光度值达
到平衡时间较短，随着处理温度的增高，吸光度值降幅变小，自由基清除能力越小。对DPPH·清除能力的大小顺序为：65℃ > 72℃ > 79℃ > 86℃ > 93℃。
Figure 5. Eliminating DPPH· kinetic curve of different temperature
图5. 不同温度样液清除DPPH·动力学曲线
3.3.2. 不同pH值处理下石榴汁DPPH·的清除能力测定
图6为不同pH值处理下鲜石榴汁清除DPPH·的动力学曲线。由图6可知，加入不同pH值处理后的样液，0~5 min内，吸光度值快速下降，5~10 min吸光度值仍在下降，但降幅减少，15 min后吸光度值逐渐趋于平缓不再波动。当pH = 3.9时，吸光度值降幅最大。以pH = 3.9为分界点，当pH值大于3.9时，随着pH值的增加，吸光度值降幅逐渐减小，自由基清除能力越小。当pH值小于3.9时，随着pH值的减少，吸光度值降幅逐渐减小，自由基清除能力越小。
Figure 6. Eliminating DPPH· kinetic curve of different pH samples
图6. 不同pH值样液清除DPPH·动力学曲线
3.4. 不同温度和pH值处理下石榴汁还原力的测定
3.4.1. 不同温度处理下石榴汁还原力的测定
本文对不同温度处理下鲜石榴汁的还原力进行了测定，测定结果如图7所示，前四组样液吸光度值差别不太明显，都可作为电子供应者，但比较得出当温度为65℃时，吸光度值最高。随着温度的升高，吸光度值逐渐减小。说明随着温度的升高，石榴汁对三价铁离子还原作用越低，还原力越低。比较各个温度下石榴汁的还原力的最终结果为：65℃ > 72℃ > 79℃ > 86℃ > 93℃。
Figure 7. Effect of different temperature on the reducing force of sample solution
图7. 不同温度对样液还原力的影响
Figure 8. The effect of different pH values on the force of the sample liquid
图8. 不同pH值对样液还原力的影响
3.4.2. 不同pH值处理下石榴汁还原力的测定
图8是不同pH值处理下鲜石榴汁的还原力测定结果。由图8可知，当pH = 3.9时，石榴汁的吸光度值达到最大值2.177，当pH = 5.4时，石榴汁的吸光度值最小。随着pH值逐渐升高，吸光度值先上升达到最高点后开始下降。以pH = 3.9为分界点，当pH值大于3.9时，随着pH值的增加，吸光度值降幅逐渐减小，还原能力越小。当pH值小于3.9时，随着pH值的减少，吸光度值减少，说明当pH = 3.9时，石榴汁有很大的还原力。
4. 结论
本文经过预实验后，分别选择温度为65℃、72℃、79℃、86℃、93℃，pH值为3.4、3.9、4.4、4.9、5.4进行处理。得出：
1) 同一pH值下，当温度为65℃时，鲜石榴汁总酚，黄酮含量最高，分别为：0.214 mg/mL、0.152 mg/mL。同一温度下，当pH = 3.9时，鲜石榴汁总酚，黄酮含量最高，分别为：0.131 mg/mL、0.074 mg/mL。本实验中鲜石榴汁原本的pH值测定为4.1。是否在小于自身pH的环境中对多酚含量的影响比在大于自身pH的环境中对多酚含量的影响更小一些需要更详细的研究还有待观察。
2) 样液中都具有一定的清除能力，其中同一pH值下，不同温度处理的石榴汁的清除能力大小为：65℃ > 72℃ > 79℃ > 86℃ > 93℃。在同一温度下，不同pH值处理的石榴汁清除能力大小为：3.9 > 3.4 > 4.4 > 4.9 > 5.4。
综合上述结论，在选择的五组温度和pH值中，65℃为较为合适的处理温度，3.9为较为合适的处理pH值。
致谢
感谢本文的通讯作者，我的指导老师肖春玲。她对我论文的研究方向提出了指导性的建议，在论文实验过程中提供了经费的支持，并给予我悉心指点，为整个实验的完成，投入了很多的心血和精力。
基金项目
山西师范大学质量工程项目(2017YZKC-06)。
NOTES
*通讯作者。