1. 引言
茶树油是从互叶白千层茶树树叶中通过蒸汽蒸馏提取的精油，外观为透明淡黄色液体，主要成分为挥发性物质、8-桉树油素和4 -羟基萜烯，具有温和的气味 [1]。茶树油具有显著的抑菌、抗炎、抗癌等生物活性 [1]。研究显示，4-羟基萜烯含量是决定茶树油生物活性的主要物质。茶树油对于多种食源性和病原性微生物具有显著的生长抑制作用，可以作用于微生物的细胞膜，破坏细胞膜结构，促进细胞质外流，造成微生物死亡 [2]。但是茶树油不能溶于水，限制了其在食品以及其他领域的应用。
纳米乳液是由不相溶的水相和油相在乳化剂的作用下形成的动力学稳定的胶体系统 [3]。超声波处理和超高压均质处理是制备纳米乳液的常用方法，在低温条件下，超声波作用可以促进油相和水相的互溶，促进乳化剂覆盖在油水界面，形成稳定的纳米乳液 [4]。一般认为纳米乳液稳定性高于普通乳液，粒径分布、表面电荷值、表面包埋层等性质对于纳米乳液的稳定性具有重要的影响。
本研究以茶树油作为油相，通过超声波处理制备纳米乳液，同时壳聚糖对纳米乳液进行包埋处理，对纳米乳液的抑菌活性和皮肤创伤愈合促进作用进行了研究。
2. 材料与方法
2.1. 主要仪器与材料
茶树油，吐温20，大豆磷脂(纯度大于90%)购自阿拉丁，壳聚糖(低粘度)，冰醋酸购自国药集团，UV-vis吸光光度计(北京华科仪科技股份有限公司)，超声波破碎仪(上海豫明)，磁力搅拌器(南京舜玛)，超纯水机(上海茸研)，DLS激光粒度仪(ZS90，英国马尔文)，其他常规药品购自国药集团。
2.2. 纳米乳液制备
茶树油纳米乳液制备过程参照文献，并做一定修改 [4]。将5 g吐温20和1 g大豆磷脂溶解于90 mL蒸馏水中，磁力搅拌充分溶解后滴加5 mL茶树油，900 rpm继续磁力搅拌1小时，制备粗乳液。将粗乳液转移至超声波破碎仪中，设定功率为350 W，处理时间10分钟，连续处理5秒间隔1秒，乳液在冰水浴条件下处理。结束后，转移至透明样品瓶保存。
2.3. 纳米乳液粒径、PDI以及表面电荷值检查
使用马尔文激光粒度仪(Malvern Nano ZS90)检测乳液的粒径、PDI和zeta表面电荷值。将乳液用移液枪转移至专用粒径测量池中，检测波长为630 nm，测量乳液的平均粒径、PDI和zeta值。
2.4. 抑菌圈法检测纳米乳液的抑菌活性
参照相关文献，利用抑菌圈检测茶树油纳米乳液对两种代表性病源微生物的抑制作用 [5]。首先，液体细菌培养基培养大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，600 nm测OD值，将OD值调整到1左右，吸取0.1 mL培养液，均匀涂布在固体培养基上，将提前灭菌的不锈钢牛津杯至于固体培养基中间，移液器移去0.1 mL纳米乳液至不锈钢牛津杯中，37℃培养24小时，观察抑菌圈，并测量记录抑菌圈直径。
2.5. 最小抑菌浓度
参照相关文献，检测纳米乳液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度 [6]。液体细菌培养基培养大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，将OD值调整到1左右，移液枪转移0.1 mL培养液到9 mL空白液体培养基中混合均匀，然后加入经过稀释的纳米乳液，充分混合，培养24小时后于600 nm条件下测吸光值，不接菌的培养液做对照，吸光值为0的纳米乳液的浓度为最小抑菌浓度。
2.6. 纳米乳液对小鼠皮肤创伤的愈合促进作用
动物实验在合肥工业大学食品与生物工程学院动物实验室进行，动物实验通过合肥工业大学实验动物伦理委员会的审查。28只雄性昆明小鼠购自安徽医科大学实验动物中心，平均体重26 ± 2 g。将小鼠在动物实验室中饲养，温度为23 ± 2℃，湿度为55 ± 5%。将所有小鼠适应饲养1周，然后分为4个实验组，包括不进行治疗的对照组，进行药物治疗的阳性组(结痂宁，治疗烫伤的中草药煎药，从当地药店购买)，茶树油纳米乳液组(TNE)和壳聚糖茶树油纳米乳液组(CTNE)治疗组。用动物专用电子剃毛刀去除小鼠背部的毛发，形成4厘米 × 3厘米的无毛区域。参照报道方法建立皮肤烫伤小鼠模型，对脱毛的皮肤用蘸有90℃热水的棉球烫伤 [7]。从第二天起，将TNE (用等体积的1%乙酸稀释)，CTNE和草药每天两次分别施用于各组小鼠的烫伤皮肤，对照组用蒸馏水治疗，实验持续时间为18天。在实验期间监测烫伤皮肤组织的面积大小和体重。实验结束时，将烫伤皮肤组织用苏木精和曙红(H & E)染色后，并在光学显微镜下观察。
3. 结果与讨论
3.1. 纳米乳液的制备
超声波处理过程中，粗乳液发生破碎分离，粒径逐渐减小，经一定功率和处理一定时间后可以形成纳米乳液。与粗乳液或微乳液相比，纳米乳液外观更加透明，透光性增加。在本研究条件下，经过10分钟的超声波处理后，DLS检测纳米乳液的直径为36 nm左右。PDI值用来表征纳米乳液的粒径分布情况，PDI越大说明乳液的粒径分布越分散，预示纳米乳液容易发生分层或沉淀等现象；反之PDI值小于0.3一般认为纳米乳液分布较为集中，也预示稳定性较高。本研究纳米乳液的PDI为0.15左右，说明纳米乳液分布非常集中，稳定性较高。Zeta值用来表征纳米乳液的表面电荷性质，绝对值越大说明其相互之间电荷排斥力也越大，乳液系统也越稳定。一般认为zeta绝对值在25 mV以上则预示乳液系统非常稳定 [8]。本研究纳米乳液的zeta值为−20 mV，因此后期利用壳聚糖对纳米乳液进行了包埋处理。
壳聚糖可以溶解于1%醋酸溶液以及其他酸性溶液里，由于带有氨基，因此在溶液中带有正电荷，广泛用于纳米递送体系的包埋等处理。壳聚糖包埋处理不仅可以改变纳米乳液的表面电荷性质，还可以赋予纳米乳液表面一层多糖包埋层，由于空间位阻作用，提高纳米乳液的稳定性。经过壳聚糖包埋后，纳米乳液的粒径为38 nm，有所上升，PDI值没有明显变化，为0.16，zeta值变为15 mV，进一步验证了壳聚糖成功对纳米乳液进行包埋。
与传统微乳液相比，纳米乳液粒径小，布朗运动强烈，动力学稳定性较高，经过室温贮藏稳定性试验，发现室温条件下贮藏1个月后主要理化参数没有明显改变，说明茶树油纳米乳液和壳聚糖包埋纳米乳液的稳定性较高。
3.2. 纳米乳液的抑菌活性
茶树油具有显著的抑菌活性，可以抑制多种食源性和病原性微生物的生长，一般认为作用机理为茶树油中的4-羟基萜烯与微生物的细胞膜结合，破坏细胞膜结构，促进细胞质流出，杀死微生物。本研究选取革兰氏阴性和阳性菌代表大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，使用透明圈法检测其抑菌活性。结果显示，茶树油纳米乳液和经过壳聚糖包埋的茶树油纳米乳液对选择的两种微生物都具有显著的抑菌活性(表1)。
纳米乳液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈分别为26.6 mm和24.3 mm；壳聚糖纳米乳液处理后，抑菌圈显著扩大，分别为30.3 mm和27.3 mm，可能由于壳聚糖本身具有显著抑菌活性，经过壳聚糖包埋后增加了茶树油纳米乳液的抑菌能力。
Table 1. Inhibition zone result of tea tree oil to E. coli, Staphylococcus aureus
表1. 茶树油纳米乳液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌圈结果
通过检测纳米乳液的最小抑菌浓度，可以确定纳米乳液作为抑菌剂的使用浓度。结果显示，针对大肠杆菌，纳米乳液和壳聚糖纳米乳液的最小抑菌浓度均为0.8 mg/mL，针对于金黄色葡萄球菌，纳米乳液的最小抑菌浓度为3.2 mg/mL，而壳聚糖纳米乳液的最小抑菌浓度显著低于纳米乳液，为0.2 mg/mL左右(图1)。也验证了抑菌圈的结果，说明经过壳聚糖包埋后，纳米乳液的抑菌能力提高。
3.3. 纳米乳液创伤皮肤促进愈合作用
茶树油具有显著的抑制微生物生长能力，因此被广泛用于个人护理产品中，例如牙膏和化妆品 [9] [10]。在本研究中，使用小鼠皮肤烫伤模型评估了茶树油纳米乳液(TNE)和壳聚糖包埋茶树油纳米乳液(CTNE)的创伤皮肤愈合效果。在实验期间，每两天测量一次体重和伤口组织的大小。结果显示，不同小鼠组之间的体重和伤口组织(瘢痕)的大小无显着差异(图2和图3)。但是与其他组相比，经茶树油纳米乳液处理的小鼠的伤口组织较小，表明茶树油纳米乳液在一定程度上可以促进皮肤伤口愈合。
Figure 1. The minimal inhibitory concentration curve of tea tree oil nanoemulsion (TNE) and chitosan coated TNE (CTNE) to E. coli and S. aureus
图1. 茶树油纳米乳液(TNE)和壳聚糖包埋茶树油纳米乳液(CTNE)对于大肠杆菌(E. coli)和金黄色葡萄球菌(S. aureus)的最小抑菌浓度曲线
Figure 2. Body weight changes of skin trauma model mouse during treatment, blank is normal mice (without trauma treatment), negative is distilled water treated mice, TNE is tea tree oil nanoemulsion treatment group, CTNE is chitosan-coated tea tree oil nanoemulsion treatment group, positive for drug treatment group
图2. 皮肤创伤模型小鼠处理过程中体重变化，blank为正常小鼠(不进行创伤处理)，negative为蒸馏水处理小鼠，TNE为茶树油纳米乳液处理组，CTNE为壳聚糖包埋茶树油纳米乳液处理组，positive为药物处理组
Figure 3. Wound area changes of skin trauma model mouse during treatment, negative is distilled water treated mice, TNE is tea tree oil nanoemulsion treatment group, CTNE is chitosan-coated tea tree oil nanoemulsion treatment group, positive for drug treatment group
图3. 皮肤创伤模型小鼠处理过程中伤口面积变化，negative为蒸馏水处理小鼠，TNE为茶树油纳米乳液处理组，CTNE为壳聚糖包埋茶树油纳米乳液处理组，positive为药物处理组
另一方面，经茶树油纳米乳液和壳聚糖茶树油纳米乳液处理的小鼠的瘢痕组织厚度小于阴性和阳性对照组。此外，疤痕脱落后，H & E染色后可发现新生表皮的组织形态学特征(图4)也有一定的区别。发现阳性药物治疗小鼠的表皮比茶树油纳米乳液和壳聚糖包埋的茶树油纳米乳液治疗的小鼠表皮薄，与正常小鼠皮肤结构相似。以上结果表明，茶树油纳米乳液和壳聚糖包埋茶树油纳米乳液可以促进皮肤生长，这可能是由于茶树油具有很强的抗微生物和抗炎能力 [11]。在感染了金黄色葡萄球菌的人类伤口组织上直接进行茶树油治疗(浓度为3.3%)可以提高治愈率并减少疤痕大小 [12]，茶树油处理创伤皮肤还显著缩短治愈时间 [13]。本研究结果表明，茶树油纳米乳液也具有显著的伤口愈合作用，这可能归因于其抗菌能力。
Figure 4. Representative pictures of skin trauma experiment process and skin tissue morphology: (a) mouse back skin after epilation; (b) mouse skin after 30 minutes of burns; (c) mouse skin after 2 hours of burns; (d) burns untreated scalded mice 1 week after initiation, used as negative control; (e) scalded mice treated with tea tree oil nanoemulsion for 1 week; (f) chitosan coated tea tree oil nanoemulsion treated for 1 week; (g) scalded mice treated with drug for 1 week; (h) skin appearance after scar healing; (i) histomorphological images of healing skin of drug treated mice; (j) histomorphological images of mouse skin treated by tea tree oil nanoemulsion; (k) histomorphological images of skin of mice treated by chitosan-coated tea tree oil nanoemulsion; (l) histomorphological images of skin healing of negative control mice, The arrow points to the new skin tissue; the magnification of the i-l microscope picture is 100 times
图4. 皮肤创伤实验过程代表图片以及皮肤组织形态：(a) 脱毛后的小鼠背部皮肤；(b) 烫伤30分钟后对小鼠皮肤；(c) 烫伤2小时后对小鼠皮肤；(d) 烫伤开始1周后未经治疗的烫伤小鼠，用作阴性对照；(e) 茶树油纳米乳液处理1周的烫伤小鼠；(f) 壳聚糖包埋茶树油纳米乳液处理1周的烫伤小鼠；(g) 药物治疗1周的烫伤小鼠；(h) 疤痕愈合后的皮肤外观；(i) 药物治疗小鼠的愈合皮肤的组织形态学图像；(j) 经茶树油纳米乳液处理的小鼠皮肤愈合的组织形态学图像；(k) 壳聚糖包埋茶树油纳米乳液治疗的小鼠的愈合皮肤的组织形态学图像；(l) 阴性对照小鼠皮肤愈合的组织形态学图像，箭头指向新生皮肤组织；(i)-(l) 显微镜图片放大倍数为100倍
4. 结论
茶树油具有显著的抑菌和抗炎活性，纳米乳液以茶树油作为油相，将茶树油分散于水溶液中，提高其水分散性和应用范围。制备的茶树油纳米乳液粒径小，分布集中，同时稳定性较高，经过壳聚糖包埋处理后平均粒径和分布没有显著变化。茶树油纳米乳液和壳聚糖包埋茶树油纳米乳液具有显著的抑菌活性，可以抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长，同时与未包埋的茶树油纳米乳液相比，壳聚糖包埋茶树油纳米乳液的抑菌活性有所提高。茶树油纳米乳液和壳聚糖包埋的纳米乳液还可以促进皮肤伤口愈合，改善新生皮肤组织。本研究结果表明纳米乳液可以作为茶树油应用的一种重要形态，提高其抑菌等生物活性，有助于扩大茶树油应用范围。
基金项目
合肥工业大学大学生创新创业校级项目，X201910359417。
NOTES
*对本文章贡献相同，为共同第一作者。
#通讯作者。