无症状性脑梗死患者Hcy水平及MTHFR基因C677T多态性的相关性研究

Association of Homocysteine Level and MTHFR Gene C677T Polymorphism with Asymptomatic Cerebral Infarction

摘要: 目的：探讨无症状性脑梗死(SBI)患者少见危险因素Hcy水平及MTHFR基因C677T多态性的相关性。方法：收集2014年1月至2020年2月就诊于克拉玛依市中心医院115例明确诊断为SBI患者及123例健康体检者，分为SBI组和非SBI组。使用统一标准化登记表记录既往病史，均完善MTHFR基因C677T多态性测定、Hcy水平测定(Hcy ≥ 15 umol为HHcy)、生化指标测定、头颅MRI、颈部血管超声等。结果：发现高血压、糖尿病、高脂血症、动脉粥样硬化斑块形成、吸烟、饮酒均是SBI组危险因素，差异具有统计学意义(P < 0.05)。MTHFR基因C677T多态性包括(CC、CT、TT)，在SBI组中分别占28.70%、39.1%、32.2%。非SBI组中分别占36.6%、48.8%、14.6%。其中TT基因型在SBI组中明显高于非SBI组，差异有统计学意义(P = 0.002)，Hcy水平在SBI组高于非SBI组，差异具有统计学意义(P = 0.005)。SBI相关危险因素多重Logistic回归分析发现TT基因型、HHcy (Hcy ≥ 15 umol/L)、高血压、吸烟差异有统计学意义(P < 0.05)。结论：SBI组TT基因型占比多于非SBI组，且差异具有统计学意义。SBI组Hcy水平高于非SBI组，差异有统计学意义。SBI组三种基因型中TT基因型人群的血浆Hcy水平高于非SBI组，差异有统计学意义。TT基因型、HHcy (Hcy ≥ 15 umol/L)、高血压、吸烟为SBI独立危险因素。

Abstract: Objective: To investigate the relationship between Hcy level and C677T polymorphism of MTHFR gene in patients with silent cerebral infarction (SBI). Methods: A total of 115 patients who were diagnosed as SBI patients and 123 healthy patients in Karamay Central Hospital from January 2014 to February 2020 were collected and divided into SBI group and non-SBI group. A unified standardized registration form was used to record the past medical history, and the MTHFR gene C677T polymorphism determination, Hcy level determination (Hcy ≥ 15 umol is HHcy), biochemical index determination, cranial MRI, cervical vascular ultrasound, etc. were perfected. Results: It was found that hypertension, diabetes, hyperlipidemia, atherosclerotic plaque formation, smoking, and alcohol consumption were all risk factors in the SBI group, and the difference was statistically significant (P < 0.05). The C677T polymorphisms of MTHFR gene include (CC, CT, TT), which accounted for 28.70%, 39.1%, and 32.2% in the SBI group, respectively. The non-SBI group accounted for 36.6%, 48.8%, and 14.6%. The TT genotype in the SBI group was significantly higher than that in the non-SBI group, and the difference was statistically significant (p = 0.002). The Hcy level in the SBI group was higher than that in the non-SBI group, and the difference was statistically significant (P = 0.005). Multiple Logistic regression analysis of SBI-related risk factors found that TT genotype, HHcy (Hcy ≥ 15 umol/L), hypertension, and smoking were statistically significant (P < 0.05). Conclusion: The proportion of TT genotype in SBI group is more than that in non-SBI group, and the difference is statistically significant. The Hcy level in SBI group was higher than that in non-SBI group, and the difference was statistically significant. The plasma Hcy level of TT genotype in SBI group was significantly higher than that of non-SBI group. TT genotype, HHcy (Hcy ≥ 15 umol/L), hypertension and smoking were independent risk factors of SBI.

1. 引言

无症状性脑梗死(silent brain infarction, SBI)是指既往无脑卒中或TIA病史，头颅CT或MRI发现有脑梗塞灶或脑软化灶且与脑血管分布一致，而临床上没有与病灶相关的神经功能缺损的症状和体征 [1] [2]。由于SBI患者无任何临床症状或仅仅有极其隐匿的临床症状，所以SBI不容易引起人们的重视，极易被人们忽视，继而进一步发展为症状性脑梗死，造成巨大的家庭及社会负担。

同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是蛋氨酸代谢过程中的中间产物，亚甲基四氢叶酸还原酶(methleneterahudrofolate reductase, MTHFR)即蛋氨酸循环中影响Hcy代谢的关键酶，当MTHFR基因C677T突变可导致血浆Hcy升高。近年相关研究认为 [3] [4] HHcy与症状性脑梗死密切相关，是症状性脑梗死的独立危险因素。HHcy、MTHFR基因C677T多态性在症状性脑梗死中研究较多，但在SBI领域的研究甚少。这可能是因为SBI无临床症状或临床症状隐匿，极易被患者及其家属忽视，但SBI相对于非SBI人群进展为症状性脑梗死风险更大，故提高对SBI患者的早诊断、早治疗对于患者的康复及生活质量的提高具有重要意义。SBI发病机制可能与症状性脑梗死相似，但并非完全一样，SBI机制尚需研究。

本研究通过回顾性分析SBI患者及同期健康体检人们的Hcy水平及MTHFR基因C677T多态性。以期探讨SBI患者Hcy水平及MTHFR基因C677T多态性的相关性，及早针对SBI危险因素进行防治，降低SBI的发率及SBI进展为症状性脑梗死的风险，为克拉玛依及周边地区SBI患者的预防及后期个性化治疗提供科学依据。

2. 资料和方法

2.1. 研究对象

选择2014年1月至2020年2月在克拉玛依市中心医院SBI患者115例，与SBI患者相匹配的123例健康人群作为非SBI组，并通过克拉玛依市中心医院伦理委员会伦理审查。

纳入标准：(1) 年满18周岁并且愿意配合行颅脑MRI、劲动脉超声、MTHFR基因检测、Hcy检测；(2) 神经系统检查无异常；(3) 理解并同意参与此项研究。

排除标准：(1) 患有严重心脏、肺部、肝脏、肾脏疾病或恶性肿瘤者；(2) 患有恶性贫血和甲状腺功能低下；(3) 服用抗癫痫药、左旋多巴、B族维生素、利尿药等药物者；(4) 患有症状性脑梗死、神经系统变性病、代谢性疾病、遗传性疾病、退行性病变等各种神经系统疾患者；(5) 不能完善头颅MRI者，如支架、钢板、钢钉等金属植入、起搏器植入等。

SBI诊断标准 [1]：① CT和(或)MRI发现脑内有梗死灶或软化灶。② 没有相应的临床表现。③ 排除其他非血管性疾病以及脑出血引起的软化灶。④ 如果DWI显示为明显高信号者，则为新发梗死灶。⑤ 没有脑梗死或TIA病史。

使用统一规范的登记表按编号收集所有研究对象的基本信息，包括所有研究对象的年龄、性别、基础疾病病史(高血压病、糖尿病、高脂血症、吸烟、饮酒)。

2.2. 研究方法

1. 血浆Hcy水平及测定

所有研究对象均需空腹采集2 ml静脉血。所有Hcy的测定均由固定化验员使用西门子ADVIA 1800全自动生化分析仪通过循环酶法试剂盒进行测定，Hcy ≥ 15 umol/L为HHcy。

2. MTHFR基因测定

所以研究对象均需采集5 ml静脉血，具体操作如下：(1) DNA 提取：根据QIAGEN试剂盒说明书提取DNA，再通过Nanodrop1000微量分光光度计测定每一份样本的浓度和纯度。(2) 引物设计：由上海英潍捷基贸易有限公司合成，引物设计参照文献：MTHFR-F：GAGGCTGACCTGAAGCACTTGA，标记Biotin；MTHFR-R：ATGCCTTCACAAAGCG-GAAGA；测序引物：5’-CGTGATGATGAAATCG-3’。(3) PCR扩增：PCR反应条件为95℃ 5 min预变性；94℃ 30 s变性，60℃ 30 s退火，72℃ 30 s延伸，共35个循环；72℃延伸10 min。(4) 基因型读取：采用Baio Array Doctor V2. 0基因芯片图像分析仪软件及生物芯片识读仪对MTHFR基因677位点的等位基因进行判读，根据基因型不同分别定义为野生型(CC)、杂合突变型(CT)和纯合突变型(TT)。

3. 头颅MRI

所以研究对象检查前均去除所有饰物，使用西门子3.0T核磁进行检查，包括T1WI、T2WI、液体衰减反转序列、DWI像和矢状位T2序列。参数设置：T1WI/SE (TR/TE = 428/10 ms)：T2W/I (TR/TE = 8000/89 ms)。发现病灶后加大扫描，选择矢状位TR/TE序列。所有MRI的判读由2名神经内科医生和1名对病史不详的影像科医生独立完成，诊断结果不一致时，应该由更高一级主任医师进行重新判断。

4. 劲动脉超声

受检者均保持平卧位，完全暴露颈部，使用德国西门子公司的彩色多普勒超声诊断仪，探头频率控制5~10 MHz进行切面扫描。

2.3. 统计学方法

统计学处理应用SPSS20.0软件。计量资料用x ± s表示，两独立样本的比较用t检验，计数资料组间比较用χ²检验，多因素分析采用Logistic回归分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. 临床资料

共纳入238例研究对象，SBI组115例，其中男性62例，女性53例，平均年龄(66.72 ± 10.42)岁。非SBI组123例，其中男性56例，女性67例，平均年龄(64.32 ± 10.20)岁，SBI组与非SBI组人口统计学和临床资料见表1，SBI组危险因素有高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟、饮酒、动脉粥样硬化斑块形成差异具有统计学意义(P < 0.05)。

Table 1. Comparison of demographic and clinical data between ACI group and non-ACI group

表1. ACI组与非ACI组的人口统计学和临床资料比较

3.2. 两组MTHFR基因型检测结果

统计分析表明SBI组相对非SBI组中TT型所占比例明显偏高，差异有统计学意义(p = 0.002)。见于表2。

3.3. SBI组与非SBI组不同MTHFR基因型(CC型、CT型、TT型) Hcy水平比较

SBI组Hcy水平较非SBI组偏高(P = 0.005)，SBI组MTHFR的TT基因型Hcy水平较非SBI组偏高(P = 0.002)，提示TT型基因可能会引起Hcy水平的升高。见表3。

Table 2. Comparison of MTHFR genotype distribution between two groups

表2. 两组MTHFR基因型分布比较

Table 3. Comparison of homocysteine levels of different MTHFR genotypes (CC, CT, TT) between SBI and non-SBI groups

表3. SBI组与非SBI组不同MTHFR基因型(CC型、CT型、TT型) Hcy水平比较

3.4. SBI相关危险因素Logistic回归分析

将表1~3中有统计学意义(P < 0.05)的危险因素(高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟、动脉硬化、Hcy、TT基因型)进行多因素Logistic回归分析(表4)，其中Hcy水平分为<15 umol/L和≥15 umol/L两个分段，结果显示：高血压、HHcy (Hcy ≥ 15 umol/L)、吸烟、TT基因型为SBI独立危险因素。

Table 4. Logistic regression analysis of risk factors related to SBI

表4. SBI相关危险因素Logistic回归分析

4. 讨论

SBI是一种起病隐匿，容易被大众所忽视的特殊类型的脑梗死。随着影像学技术的广泛应用和发展，越来越多的SBI病例被人们所知晓和重视。研究证实SBI临床上并非绝对无症状，患者可以出现认知功能下降、精神障碍等非特异表现。SBI发生卒中的风险是非SBI患者的2倍 [5] [6]。目前SBI发病机制仍不清楚，可能与症状性脑梗死的发病机制相似，但二者并非完全等同。年龄、高血压病、糖尿病、高脂血症、吸烟、饮酒等均已被发现与SBI存在相关性 [7] [8] [9]，这与本研究结果基本一致。

人体Hcy水平受多重因素影响，其中包括年龄、性别、生活方式、叶酸水平、遗传因素等。在遗传因素中MTHFR C667T基因多态性是非常重要的影响因素 [10] [11] [12]。亚甲基四氢叶酸还原酶(methleneterahudrofolate reductase, MTHFR)是影响Hcy代谢的一个关键酶，MTHFR基因C677T突变[胞嘧啶碱基(C)突变为胸腺嘧啶(T)]可导致其编码的氨基酸丙氨酸被缬氨酸取代，导致MRHFR稳定性和活性下降，Hcy甲基化为蛋氨酸过程受阻，Hcy蓄积，引起HHcy [16] [17] [18]。多项研究证实HHcy是症状性脑梗死的独立危险因素 [13] [14]，目前SBI已明确的危险因素主要有年龄、高血压病、糖尿病、高脂血症、吸烟、饮酒等 [15]。但关于SBI患者Hcy水平及MTHFR基因多态性研究较少。有研究 [19] 显示SBI组患者的血Hcy明显高于对照组，经过logistic多因素相关分析也证实其与SBI呈正相关，高Hcy血症是SBI的独立危险因素，这与我们得出的研究结果一致。有研究结果显示 [20] [21] [22] TT型人群Hcy水平平均升高5.18 μmol/L，我们也发现TT基因型人群Hcy水平高于其他人群Hcy水平。我们还发现SBI组Hcy水平高于非SBI组，且差异具有统计学意义，SBI组TT型Hcy水平比非SBI组TT型高，差异具有统计学意义，这与上诉研究结果基本一致。我们发现MTHFR基因多态性TT型及HHcy与SBI相关，除了常见SBI危险因素外，HHcy、TT基因型血症是SBI的独立危险因素。

本研究首次在新疆克拉玛依地区通过对MTHFR C667T基因多态性、Hcy水平与SBI的相关性进行分析。我们得出：TT基因型、Hcy水平、高血压、吸烟是SBI患者的独立危险因素。这可能与新疆生活环境、饮食习惯、基因相关，在日常诊疗过程中对于SBI患者我们应该尽可能明确患者的MTHFR基因型，纠正血浆Hcy水平、高血压、吸烟等危险因素，针对TT型HHcy的患者，更要注重卒中的危险因素的预防工作，尽可能降低患者进展为症状性脑梗死或痴呆的概率。综上所述，HHcy和MTHFR C677T基因多态性与SBI密切相关。对于SBI患者需要全面综合评估，从而制定防治方案。

伦理声明

本研究所做所有研究均是取得项目参与者同意并签署知情同意书，在研究过程中符合伦理学要求，无违背伦理学相关规定行为。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。