摘要: 以阿克苏地区农田防护林胡杨树(Populus euphratica)腐烂病病菌为研究材料，采用常规组织分离法进行分离纯化，观察形态学特征并结合ITS与β-tubulin序列进行鉴定。利用邻接法(Neighbor-joining, NJ)构建系统发育树，进行序列分析。结果表明代表菌株的菌落形态为白色、羽毛状，有气生菌丝产生，后期出现黑色产孢体。分生孢子器浅埋于树皮下，器壁黑褐色、内陷，孔口1个，分生孢子器由9至14个小腔室组成，共用璧，呈散射状分布，形态学特征均符合金黄壳囊孢(Cytospora chrysosperma)，ITS与β-tubulin序列与金黄壳囊孢(C. chrysosperma)同源性高达99%以上。通过致病性测定显示分离菌为胡杨的致病菌与新疆巴州胡杨腐烂病病原菌相同。
Abstract:
Populus euphratica rot pathogen surrounding farmland shelterbelt was used as the research material in the Aksu region, and was isolated and purified by conventional tissue separation method. Morphological characteristics were observed and ITS and β-tubulin. The phylogenetic tree was constructed using Neighbor-joining (NJ) for sequence analysis. The results show that the colony morphology of the strain was white and feathery, with the generation of air-borne mycelium and the emergence of black sporogenesis in the later period. Conidia are shallowly buried under the bark, with conidium wall dark brown and sunken, and 1 orifice. Conidia are composed of 9 to 14 small cavities, sharing the same wall, with scatter-like distribution. Morphological characteristics are consistent with C. chrysosperma. Both are in line with C. chrysosperma. Biological analysis shows that the ITS and β-tubulin sequences are more than 99% homologous to C. chrysosperma. It is the same as the pathogen of Populus euphratica in Bazhou, and the pathogen of Populus euphratica.
1. 引言
胡杨(Populus euphratica)作为新疆绿洲农业主要的防护林具有防风、防沙和抗旱的作用，是新疆农业生产的一道天然屏障 [1]。不仅可以确保农作物稳产高产、能够改善农田小生态系统 [2]，对旅游业的经济发展也起到积极作用，具有观赏价值。有研究显示新疆的农田防护林的生态服务价值巨大，可达上千亿元 [3]。近年来阿克苏地区主要防护林胡杨树腐烂病发生严重，造成了许多胡杨树势衰弱，发生死亡，给依赖于防护林发展的绿洲农业带来了危害，同时也制约了胡杨旅游业的发展。腐烂病是一种对林果树木危害极大的病害，严重影响树木的寿命 [4]。腐烂病会造成树木抗逆性变弱，树枝或树干腐烂干枯，最终导致木质部和形成层细胞死亡，进而影响树体的营养供给造成死亡 [5]。我国目前腐烂病主要发生于苹果、梨树、杨树、柳树和核桃等植物上 [6] [7] [8]。其中引起苹果树腐烂病病原菌为黑腐皮壳菌(Valsa mali) [8]、梨树腐烂病病原菌为梨黑腐皮壳菌(Valsa ambiens) [9]，而引起杨树、柳树和核桃腐烂病病原菌都为金黄壳囊孢(C. chrysosperma) [10] [11]。胡杨分布新疆、青海、甘肃、内蒙古、宁夏等省区 [12]，胡杨腐烂病的发生在新疆巴音郭楞蒙古自治州、甘肃民勤都分别有报道 [13] [14]，其他地区暂未发现报道。为防止胡杨腐烂病给阿克苏地区农田防护林带来更大的损失，针对阿克苏地区胡杨腐烂病的病原菌作出调查，从形态学出发，以分子手段辅助，分析明确该地区胡杨腐烂病种类，并且研究是否与其他地区为同种病原菌，从而为是否可以采取综合的、通用的防治手段提供理论依据。
2. 材料与方法
2.1. 材料
具有代表供试病样：病样采集地点与名称见表1。
Table 1. Disease-like information of tested rot
表1. 供试腐烂病病样信息
2.2. 方法
2.2.1. 病原菌分离纯化
将采集的病样先用清水清洗2~3次，再用蒸馏水清洗2~3次晾干待用。从病健交界处切取0.5 cm大小的小病样，75%酒精浸泡30 s，次氯酸钠浸泡30 s，无菌水浸泡2 min。均匀放置5块病样于PDA培养基中，25℃黑暗条件下培养3 d左右。待长出菌落时进行分离纯培养并保存于−4℃待用。
2.2.2. 致病性测定
将保存的菌株接种于PDA (Potato Dextrose Agar)平板25℃培养3 d，接种方法参考唐俊煜 [15] 略有改进。在塔里木大学校内分别采集胡杨树1~2年生健康枝条，剪成10 cm左右的短枝，用自来水清洗2~3次，再用蒸馏水清洗2~3次，并用75%酒精擦拭消毒。将16 × 24 cm消毒盘用处理枝条的方法进行处理后，在消毒盘上铺上2层无菌纱布，将其置于无菌操作台用紫外灯灭菌5 min。将5 mm打孔器烧烫后，在处理过的枝条上进行烫伤打孔，将培养3 d的菌株用5 mm打孔器打成菌饼接种于枝条上，置于消毒盘，做5个重复。向消毒盘加入适量的无菌水，用保鲜膜进行封口。将其置于25℃培养箱培养，每天观察发病情况。
2.2.3. 形态学鉴定
将保存的确认胡杨树腐烂病菌进行活化后，接种于PDA培养基，置于25℃培养箱。观察记录菌落形态学的特征。将长有分生孢子器的胡杨树腐烂病病样进行横纵切片，并置于体视显微镜下观察分生孢子器外部形态，横纵切面形态特征及腔室数量并测量分生孢子器和分生孢子大小 [16]。
2.2.4. 分子辅助鉴定
1) 菌体收集及DNA的提取
将培养3 d的菌株用打孔器取5~6个菌饼放置于含有50 mL PDA的150 mL的锥形瓶中，置于25℃摇床160 rpm/min培养5 d。用无菌处理的纱布过滤菌块，用无菌水冲洗3次，再用灭菌的滤纸吸干水分，经冷冻干燥后，保存于−80℃超低温冰箱中备用。采用改良的CTAB法提取胡杨树腐烂病病原菌总DNA [17]。
2) ITS与β-tubulin基因的扩增
利用真菌通用引物ITS1 (5'-CCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')对病原菌的ITS进行扩增。PCR反应程序为55℃退火30 s，72℃延伸30 s；利用真菌通用引物Bt2a (5'- GGTAACCAATGCTGCTTTC-3')和Bt2b (5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3')对病原菌的β-tubulin基因进行扩增PCR。ITS片段的PCR选用12.5 µl体系：2.5 µl 10× Buffer，2 µl dNTP (2.5 mM each)，上游引物和下游引物各0.5 µl (10 µM)，0.15 µl Ex Taq酶(5 U/ml)，1 µl的DNA模板，最后用ddH2O补足12.5 µl (TaKaRa)。反应条件为95℃预变性5 min，95C变性1 min，48℃退火1 min，72℃延伸1 min，重复进行35个循环，最后72℃延伸10 min，10℃保存。Tub片段PCR选用12.5 µl体系：2.5 µl 10× Buffer，1.8 µl dNTP (2.5 mM each)，上游引物和下游引物各0.5 µl (10 µm)，0.2 µl Ex Taq酶(5 U/ml)，1 µl的DNA模板，最后用ddH2O补足12.5 µl (TaKaRa)。反应条件为95℃预变性5 min，95C变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，重复进行35个循环，最后72℃延伸10 min，10℃保存。扩增产物经1%琼脂糖进行电泳检测后，由上海生工科技股份有限公司进行测序。
3) 系统发育树的构建
将ITS与β-tubulin序列提交至NCBI中的GenBank查找同源序列并下载，利用MEGA 5.0软件通过邻接法(Neighbor-joining, NJ)构建系统发育树进行序列分析。
3. 结果分析
3.1. 致病性测定
在健康胡杨树枝条离体接种胡杨腐烂病菌株后，均引起枝条发病。接种第7 d接种部位出现褐色、水渍状病斑，并且树皮凹陷，后期病斑扩展至整个枝条。接种第10 d接种枝条上产生小黑点，并伴有橘黄色的分生孢子角出现(图1(F))。对照未出现任何症状。经过科赫氏法则验证，分离株即为致病菌。
Figure 1. Morphological characteristics of the pathogen and Pathogenicity Determination of canker on Populus euphratica. Note: A and B: Colony morphology; C: Pycnidium cross-sections; D: Pycnidium longitudinal section; E: Conidia (four hundred); F: Pathogenicity determination
图1. 胡杨树腐烂病病原形态特征及致病性测定。注：A和B：菌落形态；C：分生孢子器横切；D：分生孢子器纵切；E：分生孢子(400)：F：致病性测定
3.2. 形态学鉴定
将胡杨树腐烂病菌株HY1等5个不同地区的菌株接种在PDA培养基，3 d菌落白色，羽毛状，有气生菌丝产生(图1(A))，后期出现黑色产孢体(图1(B))。病样表面分布有黑色突出小点，在潮湿环境下放置12 d后有橘黄色分生孢子角产生。分生孢子器浅埋于树皮下，器壁黑褐色、内陷，孔口1个。将小黑点切片发现分生孢子器9至14个小腔室组成，共用璧，呈散射状分布。分生孢子器横切大小为0.382 mm~0.815 mm，纵切大小为 0.153 mm~0.790 mm (图1(C)和图1(D))。分生孢子无色，月牙形，大小为(3.0~5.10) μm × (1.20~1.84) μm (图1(E))。依据形态特征初步将五个分离株初步鉴定为金黄壳囊孢(C. chrysosperma) [18] [19]。将病原菌培养3 d菌落白色，羽毛状，有气生菌丝产生，后期出现黑色产孢体。病样在潮湿环境下放置数天后有橘黄色分生孢子角产生。分生孢子器浅埋于树皮下，器壁黑褐色、内陷，孔口1个。分生孢子器横切大小为0.382 mm~0.815 mm，纵切大小为 0.153 mm~0.790 mm。分生孢子无色，月牙形，大小为(3.0~5.10) μm × (1.20~1.84) μm。并且与巴音郭楞蒙古自治州、民勤的胡杨树腐烂病为同种致病菌。
3.3. 分子鉴定
菌株HY1和HY2的ITS序列大小为590 bp，β-tubulin序列大小为500 bp。将序列提交至GenBank，通过BLAST进行序列比对。将菌株HY1、HY2、HY3、HY4和HY5的ITS序列与相似度高的序列构建系统进化树，分析发现与Cytospora chrysosperma (MK061533、MH195202、KP114134、KP114129和KC880153)关系最近(图2(A))且能看出于其他属间存在差异。将菌株HY1、HY2、HY3、HY4和HY5的β-tubulin序列与相似度高的序列构建系统进化树，分析发现与Cytospora chrysosperma (KT590410、KT590406、KP117038)关系最近(图2(B))，进一步确认为金黄壳囊孢(C. chrysosperma)。
(A)
(B)
Figure 2. Phylogenetic tree based on ITS sequences and β-tubulin sequences
图2. 基于ITS序列和β-tubulin序列构建的系统发育树
4. 讨论
本文主要对在阿克苏地区发现的胡杨腐烂病病菌进行系统发育分析，通过对其病原菌柯赫氏法则验证、观察形态学特征、并以分子学手段辅助分析。郭开发等研究发现塔里木河下游铁门关市胡杨树腐烂病病原菌为金黄壳囊孢(C. chrysosperma) [14]。这与本研究结果一致。引起新疆阿克苏地区胡杨树腐烂病病原菌同为金黄壳囊孢(C. chrysosperma)。有报道的胡杨腐烂病有新疆、甘肃，其他暂未发现。并且新疆与甘肃胡杨腐烂病致病菌的种类是否和当地林果树木腐烂病为同种病原，是否同为金黄壳囊孢(C. chrysosperma)还有待研究。在新疆，邵延慧等研究发现新疆塔里木河流域的柳树腐烂病病原菌为金黄壳囊孢(C. chrysosperma)、新疆南疆的核桃腐烂病病原菌也为金黄壳囊孢(C. chrysosperma)。唐俊煜研究发现南疆地区枣树腐烂病病原菌同为金黄壳囊孢(C. chrysosperma) [20]。说明在新疆南疆地区的林果树木腐烂病的主要致病菌之一为金黄壳囊孢(C. chrysosperma)防止胡杨腐烂病与果树相互侵染，在果园防护林的选择上，可以避开可能交互感病品种。并且在胡杨风景区等旅游场所避开果树种植 [21]。胡杨、杨树、柳树腐烂病致病菌同为金黄壳囊孢(C. chrysosperma)，除危害果树，对行道树以及护边林危害也十分严重，以上五种树之间可能会存在交互侵染，可以继续进行交互侵染研究。
5. 结论
对新疆阿克苏地区塔里木河流域周围的胡杨树腐烂病病原菌进行分离纯培养，通过致病性测定，结合形态学及分子鉴定结果，确定该病病原菌为金黄壳囊孢(C. chrysosperma)。金黄壳囊孢菌(C. chrysosperma)不同地理来源的菌株在遗传多样性上有较明显的相关性 [22]。
基金项目
大学生创新创业项目，项目编号：201910757015。
NOTES
*通讯作者。