滇池土著沉水植物根际可培养解磷菌与环境因子相关性研究

Study on the Diversity of Culturable Phosphorus Solubilizing Bacteria and Relationship between the Environmental Factors in Rhizosphere of Submerged Plants in Dianchi Lake

摘要: 为探究云南滇池4种土著沉水植物根际沉积物中可培养解磷菌群落结构和环境因子的相互关系。采用功能筛选培养的方法对15个沉水植物的根际和非根际沉积物样品中进行解磷菌分离培养，应用16S rDNA序列对分离得到的解磷菌进行系统发育分析，运用软件Biodap和冗余分析(redundancy analysis, RDA)分析解磷菌群落的丰富度及其与环境因子间的相关性。结果显示，从滇池沉水植物根际和非根际沉积物中共分离到可培养解磷菌86株，从属于8个属27个种；其中假单胞菌属(Pseudomonas)为优势菌群，占分离的22%，分布于该属的11个种；杆菌属(Bacillus)占分离总数的18%，共分离到3个种。滇池不同沉水植物根际沉积物中解磷菌的优势类群存在一定差异。冗余分析(RDA)的结果表明：沉水植物根际的沉积物中氧化还原电位(Eh)和沉积物间隙水的溶解性活性磷(SRP)对解磷菌群落结构有显著影响。

Abstract: In order to explore the community structure and environmental factor characteristics of culturable phosphate-solubilizing bacteria (PSB) in the rhizosphere sediments of four native submerged plants in Dianchi Lake, Yunnan province. [Method] By using the method of functional screening medium and basing on the 16S rDNA sequence phylogenetic analysis of PSB, the PSB strains were isolated and identified from the rhizosphere and non-rhizosphere sediments and using the software BIODAP and Canoco analysis the diversity of PSB and the relationship between the environmental factors. The results showed that 86 strains of PSB were cultured and isolated, belonging to 27 species and 8 genera. Among them, the Pseudomonas was the dominant bacterium, accounting for 22% and distributed in 11 species of this genus. The Bacillus accounted for 18% of the total isolated species, and 3 species were isolated. The community structure of PSB was significantly different in the rhizosphere and non-rhizosphere sediments of the submerged plants in Dianchi Lake. RDA analysis found that the REDOX potential (Eh) and the soluble active phosphorus (SRP) were the main environmental factors for the distribution of PSB.

1. 引言

富营养化湖泊的生态修复是环境修复的研究热点。水体富营养化和水生植被退化后，导致水体生态功能的严重退化 [1]。沉水植物是水生态系统的重要初级生产者和调节者，是富营养化湖泊稳态转换的关键生物类群之一 [2] [3]。沉水植物可以显著改善水环境，吸收水中的氮磷和有机物等营养元素和抑藻作用，能够通过生理代谢活动，如光合作用、呼吸作用等影响沉积物的理化环境，改变溶氧含量、底泥的pH值和氧化还原电位等 [4]。在浅水湖泊中沉水植物的恢复有利于提高湖泊生态系统的生物多样性和稳定性 [5]。

磷是水体富营养化的主要限制性因子之一，是影响沉水植物生长发育的重要元素 [6]。水不溶性无机磷和有机磷不能被水生植物直接利用，沉水植物能够吸收的有效磷主要来源于沉积物中的微生物磷，而调控沉积物有效磷释放的关键微生物之一是解磷菌 [7]。解磷菌可将沉积物中的难溶性磷转化为可供水生植物利用的活性磷 [8] [9]。沉水植物可以增加根际沉积物的有机质和氧的含量，提高微生物的代谢活性；而沉积物中微生物活性又可以促进植物对沉积物中磷的吸收，有利于沉积物中磷的削减，形成沉水植物——解磷菌之间的互惠关系 [10] [11] [12]。解磷菌通过参与沉积物磷的存在形式、含量和转化，对生态系统的生物群落结构与功能起着十分重要的作用，能够促进水生态形成健康稳定的系统 [13] [14]。目前，很少有研究揭示富营养化沉积物沉水植物与解磷微生物功能类群间的相互作用，探究该环境中解磷菌的群落结构和分布特征对富营养化湖泊的生态环境修复具有重要的应用和理论研究价值。

本课题拟以滇池沉水植物的根际解磷菌为研究对象，针对滇池土著沉水植物根际和非根际可培养解磷菌的群落结构和分布特征进行研究，以期为进一步研究滇池沉水植物与磷循环有关微生物的种类、生理功能和生态作用提供基础。

2. 材料和方法

2.1. 微生物培养基

采用固体培养基培养分离沉积物中的解磷菌 [15]。解磷菌分离培养基：葡萄糖10 g，(NH₄)₂SO₄ 0.5 g，KCl 0.3 g，MgSO₄∙7H₂O 0.3 g，Ca3(PO4)2 10 g，FeSO₄∙7H₂O 0.03 g，MnSO₄∙4H₂O 0.03 g，水1000 mL，琼脂20 g，pH值7.0~7.5。

采用LB培养基对分离得到的解磷菌进行纯化和保藏。LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，琼脂20 g，水1000 mL，用5 mol/L NaOH调pH至7.0。

2.2. 方法

2.2.1. 研究区域

2017年6月，结合前期关于滇池土著沉水植物分布的研究结果，定点采集滇池有沉水植物分布区(24˚52'10''N, 102˚39'41''E)和无沉水植物对照区(24˚52'20''N, 102˚39'24''E)的沉积物。滇池西岸是沉水植物分布丰富的湖滨区，采样点位于滇池西岸的西华湾，水生植物生长区域水深约2.1 m，pH为7.65，透明度为38 cm，主要分布有篦齿眼子菜、马来眼子菜、穗花虎尾草和轮叶黑藻为优势类群，沉水植物盖度在20%~30%，该区域的平均生物量可达到1.63 kg∙m²。基于前期滇池土著沉水植物分布特征调查，分别选取滇池土著沉水植物的4种优势类群作为研究对象，轮叶黑藻(Hydrilla verticillata)、篦齿眼子菜(Potamogeton pectinatus)、马来眼子菜(Potamogeton malaianus)和穗状狐尾藻(Myriophyllum spicatum)，用植物采样器将4种沉水植物连根拔起来，沉水植物根际表层2 mm的沉积物轻轻刮下，装入无菌的采样袋，每种植物采集3个植株的样品，总共采集12个样品。无植物对照区水深约3 m，pH为7.5，无植物区沉积物样品采用皮特森采泥器采集，采集3个平行样品，装入无菌的采样袋中。所有沉积物样品带回试验室后用于解磷菌的分离、筛选和鉴定，同时进行理化性质测定。

2.2.2. 样品理化性质测定

采集好的样品带回实验室，沉积物用离心机5000 rpm离心10 min获得沉积物间隙水。间隙水用微电极测定沉水植物根际和非根际沉积物中的溶解氧(DO)和氧化还原电极(Eh)。间隙水中溶解性总磷(DTP)和溶解性活性磷(SRP)按照《水和废水的监测方法(第四版)》实施测定 [16]。沉积物中总磷(TP)采用钼酸铵分光光度法进行测定 [16]，总氮(TN)的测定方法见文献 [17]，有机碳(TOC)的测定方法见文献 [18]。

2.2.3. 解磷细菌的分离纯化

将采集的不同沉水植物的根际和非根际沉积物各10 g装于100 mL无菌水的锥形瓶中混匀，进行梯度稀释，得到的1 × 10⁻⁴、1 × 10⁻⁵和1 × 10⁻⁶倍的稀释液，涂布到解磷分离培养基平板上，放置2 h后将培养皿反转，于28℃培养24 h。由于解磷细菌会溶解培养基中难溶性无机磷，具有透明圈的菌落视为具有解磷活性的菌落，将出现溶磷圈的菌株标记，根据菌落形态等特点挑选细菌单菌落，将单菌落接到LB平板上培养，继续培养纯化2~3次，获得纯培养菌株，接种至LB斜面于4℃保存。

2.2.4. 解磷菌的分子生物学鉴定

DNA提取和PCR扩增：用Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR (TaKaRa)对分离所得解磷菌进行细胞裂解，裂解后的悬液作为PCR扩增的模板。对提取的细菌16S rDNA进行PCR扩增，选择通用引物27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1541R (5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)。PCR扩增程序为：94℃ 5 min，94℃ 60 s，59℃ 60 s，72℃ 60 s，30个循环，72℃ 10 min，扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

系统发育树的构建：将供试菌株PCR扩增片段测序结果经DNAStar软件拼接后的序列在Gen-Bank 核酸序列数据(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中进行在线序列比对并选择相似性最高的相关典型菌株的16S rDNA基因序列，用CLUSTAL W软件进行多重序列比对 [19]，使用MEGA X软件的邻接法(Neighbor-joining)进行聚类分析和构建系统进化树 [20]，重复取样1000次进行自展值(Bootstrapvalue)分析，确定菌株的生物学分类地位 [21]。

2.2.5. 解磷菌多样性与环境因子相关性分析

应用BIODAP计算多样性指数分析沉水植物根际和非根际沉积物中解磷菌的多样性。将滇池不同沉水植物根际沉积物的环境因子和解磷菌群落分布特征进行数据整理，采用Canoco 5.1软件进行RDA分析，Spss软件进行显著性检验分析。利用蒙特卡洛(Monte Carlo permutation)检验分析RDA排序轴特征值的显著性，检验采用默认选项，置换次数均为499次 [22]。

3. 结果与分析

3.1. 沉水植物根际和非根际沉积物理化性质

滇池沉水植物根际和非根际沉积物中Eh和SRP含量存在明显差异。从表1中可以看出，沉水植物的根际沉积物的Eh比无植物分布的的高，表明沉水植物提高了根际沉积物中的Eh。非根际沉积物间隙水SRP是沉水植物根际沉积物的2.4~3.2倍，间隙水DTP与SRP变化相一致；但在沉水植物根际区域沉积物的SRP对DTP的贡献变化在52.9%~72.4%，非根际沉积物SRP对DTP的贡献为42.5%。不同植物根际的TN和TOC存在一定差异，并高于非根际，而非根际沉积物的TP高于植物根际。不同植物间、植物根际和非根际间的DO含量差异小。

Table 1. Physical and chemical characteristics of the rhizosphere and non-rhizosphere sediments in Dianchi Lake

表1. 滇池沉水植物根际和非根际沉积物的理化因子

注：HV，轮叶黑藻；PP，篦齿眼子菜；PM，马来眼子菜，MS，穗状狐尾藻；Non，非根际沉积物；DTP，间隙水中溶解性总磷；SRP，溶解性活性磷。

3.2. 沉水植物根际和非根际沉积物中解磷菌的群落分布

对滇池沉水植物根际和非根际沉积物中解磷菌进行分离筛选培养，共分离得到解磷菌共86株。所有菌株的16S rDNA序列在GenBank数据库进行比对分析，相似性 ≥ 97%的归为一个种，共8个属27个种(表2)。选取27个不同种代表菌株的16S rDNA序列构建系统发育树发现，沉水植物根际和非根际解磷菌主要优势属为Pseudomonas、Bacillus、Burkholderia和Microbacterium等(图1)。假单胞菌属是所有可培养根际解磷菌中的优势菌属，占总数22%，共19株11个种。杆菌属占总数的21%，18株共有3个种。Burkholderia和Microbacterium也是滇池解磷菌的优势类群，分别为15%和12%。其中，轮叶黑藻、篦齿眼子菜和穗状狐尾藻的解磷菌以Pseudomonas、Bacillus和Burkholderia三个属为主，占该植物根际解磷菌总数分别为52.9%、64.7%和63.6%；马来眼子菜以Pseudomonas、Bacillus和Ensifer三个属为主，占该植物根际解磷菌总数的52.4%；非根际沉积解磷菌没有明显的优势菌属。不同沉水植物根际的优势解磷菌类群存在一定差异。

Table 2. Distribution of PSB isolated from the rhizosphere and non-rhizosphere sediments of submerged plants in Dianchi Lake

表2. 不同沉水植物根际和非根际沉积物解磷菌群落的分布

注：HV，轮叶黑藻(Hydrilla verticillata)；PP，篦齿眼子菜(Potamogeton pectinatus)；PM，马来眼子菜(Potamogeton malaianus)，MS，穗状狐尾藻(Myriophyllum spicatum)；Non，非根际沉积物。

Figure 1. Neighbour-joining tree constructed of PSB strains based on the 16S rDNA gene sequences

图1. 基于16S rDNA基因构建的解磷菌Neighbour-joining发育树

3.3. 环境因子对解磷菌分布的影响

RDA分析结果显示，影响解磷菌分布的主要环境因子是氧化还原电位(Eh)和SRP，其中Eh对物种的影响具有显著性，Eh对群落变异的解释度为49.8% (F = 3.0, P = 0.06)，SRP对群落分布的贡献为43.4%(F = 2.3, P = 0.018)。从图2可以看出，Microbacterium的丰富度与到Eh呈正相关，且达到显著水平(P = 0.026)；Bacillus与DO呈正相关(P = 0.070)，Microbacterium和Bacillus与SRP呈负相关(P = 0.058和P = 0.155)。Pseudomonas与TP之间呈负相关(P = 0.258)，与其他优势解磷菌的相关性不高。TOC也是影响解磷菌类群在沉水植物根际和非根际沉积物中分布的关键环境因子之一。

Figure 2. RDA biplot of PSB distribution and environmental factors in Dianchi Lake

图2. 滇池沉水植物根际解磷菌分布与环境因子的RDA分析

4. 结论

4.1. 不同沉水植物根际的解磷菌分布

滇池不同沉水植物根际沉积物中解磷菌的优势类群存在一定差异。轮叶黑藻、篦齿眼子菜和穗状狐尾藻的解磷菌以Pseudomonas，Bacillus和Burkholderia三个属为主，占该植物根际解磷菌总数分别为52.9%、64.7%和63.6%，组成比例存在差异。马来眼子菜以Pseudomonas、Bacillus和Ensifer三个属为主，占该植物根际解磷菌总数的52.4%，与其它3种植物的解磷优势类群不一样。无植物分布区域的沉积物中解磷菌没有明显的优势菌属。相关研究表明，沉水植物的类型对微生物群落结构有着显著影响 [23]。沉水植物通过根系活动改变根际沉积物的营养物质、pH及其它理化性质，改变了根际微生物群落的结构，使得不同沉水植物的根际解磷菌存在差异。与其它研究结果相似，Pseudomonas和Bacillus是植物根际土壤占主导地位的解磷菌属，占据了超过了55%的解磷微生物数量 [24]。在滇池上层沉积物的解磷菌区系研究中，Bacillus是分布最广的类群 [25]。在长江口表层沉积物中的解磷菌也是以Bacillus为优势属 [7]。关于解磷菌的报道较多是针对土壤中的解磷菌的分离，而解磷菌的种类也较多集中在Pseudomonas和Bacillus等，有关沉积物的解磷菌也较多集中湖泊和湿地的沉积物中。

4.2. 沉水植物根际解磷菌与环境因子相关性

沉水植物根际的沉积物中氧化还原电位(Eh)和沉积物间隙水的溶解性活性磷(SRP)对解磷菌群落结构有显著影响。沉水植物可以使沉积物有氧层厚度增加，改变沉积物的氧化还原电位，进而改变了根际微环境中微生物的数量和种类 [26]。在与湖泊类似的人工湿地底泥中植物根际促进沉积物中氧化层形成，氧化层中氧化还原电位比污染层升高150% [27]。相关研究也发现，沉水植物的代谢活动会提高根际沉积物中氧化还原电位，进而影响微生物的群落结构 [28]。沉水植物通过提高沉积物中氧化还原电位，氧化还原电位与解磷功能微生物的分布呈正相关性。在沉水植物分布的区域，沉积物有机质(TOC)和溶解氧(DO)的增加也会促进解磷细菌的代谢活动，使得沉水植物根际沉积物的解磷菌丰富度高于非根际 [29] [30]。同时，在沉水植物苦草根系的吸收以及根系周围形成的微生物，对于磷的去除有着良好的效果 [31]；解磷菌参与沉积物中有效磷的释放，使得沉水植物根际沉积物中TP高于非根际沉积物。在滇池底泥磷高含量区域，解磷菌的种群和数量与底泥磷含量成负相关关系 [32]。研究结果也发现，沉水植物能够吸收根际沉积物中SRP [33]；进而影响解磷群落结构的分布与SRP呈负相关。沉水植物吸收的有效磷直接来自于沉积物，而沉积物中的解磷细菌促进了沉积物中SRP的释放 [34]。沉水植物根际沉积物中解磷菌的数量和种类分布特征与环境因子密切相关。沉水植物根际沉积物有较高含量TOC和DO等有利条件，也会提高解磷细菌群落的多样性，为解磷细菌的生存提供了特定的微生态环境，进而解磷细菌增强了植物对根际沉积物中有效磷的吸收，保障了沉水植物生长的稳定。

基金项目

云南省地方本科高校(部分)基础研究联合专项资金项目(2017FH001-111, 202001BA070001-163)、昆明学院校级人才引进项目(YJL19004)。