1. 前言
条斑紫菜(Phycocalidia yezoensis)为红毛菜科(Bangiaceae)紫菜属(Phycocalidia)植物，是重要的海洋经济藻类，长江以北的江苏南通、盐城、连云港沿海为人工栽培主产区位，产量占全国条斑紫菜总产量的97%以上 [1]。紫菜中的氨基酸不仅种类齐全，含量丰富，除蛋白质氨基酸外，还含有丰富的游离氨基酸 [2] [3]；而且必需氨基酸组成比例符合FAO/WHO (1973年)推荐的理想蛋白质模式，可与蛋、乳等蛋白的营养价值相媲美 [4] [5]。
目前，对紫菜氨基酸研究主要集中在氨基酸的组成 [6] [7]、游离氨基酸 [8] [9] [10]、脂脂肪酸及矿物质的含量 [11] [12] 等方面，以及不同采收期不同品系条斑紫菜中氨基酸含量的变化 [13] [14]。在不同栽培海区中氨基酸的变化情况报道较少，仅纪明候等 [15] 对青岛不同海区条斑紫菜进行了氨基酸含量变化的研究，分析认为，紫菜中的氨基酸随着生长周期的不同呈现一定的变化规律，并得出高肥区(总无机氮)条斑紫菜中的总氨基酸高于中肥区和低肥区。本研究采用邻苯二甲醛/9-氯甲酸芴甲酯(OPA/FMOC)柱前衍生反相高效液相色谱法首次对江苏条斑紫菜主产区5个站位及5个不同采收期的条斑紫菜叶状体进行氨基酸分析，采用LACHAT 8500流动注射分析仪，对取样点栽培海区进行总无机氮(硝氮、亚硝氮及氨氮三项之和)测定，以探索不同生境条件下条斑紫菜叶状体氨基酸的组成变化规律，以及氨基酸与栽培海区中氮含量变化的相关性。结果表明条斑紫菜的氨基酸含量与总无机氮的值相关性最大，而其氨基酸含量与总无机氮中硝态氮和氨态氮的组成比例相关性不大。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
实验所用的条斑紫菜叶状体及栽培区海水样品采自江苏沿海条斑紫菜主产区海门、北渔、环渔、大丰及连云港的5个站位点，依次为站位1至站位5，(图1)；5个不同采收期为：2018年12月、2019年1月、2月、3月及4月，每次样品采集3个平行样品，所采集紫菜叶状体样品的种质均为江苏省海洋水产研究所国家级紫菜种质库提供的Y-9008。样品材料冷藏取回实验室后用灭菌海水洗净、阴干、粉碎后－20℃保存。海水样品经孔径为0.45微米混合纤维素膜过滤后，放入100 ML聚乙烯瓶中冷冻保存，运回实验室进行氮元素的检测。
Figure 1. The different positions of samples
图1. 样品采集站位示意图
2.2. 材料前处理
叶状体样品材料保鲜带回实验室，−20℃保存。
样品研磨后过0.15 mm孔径筛，准确称取0.1 ± 0.005 g样品于特制的水解管中，缓慢加入8 mL 6 mol/L HCL溶液(其中色氨酸的分析用6 mol/L KOH溶液)，并轻轻转动水解管，保证样品全部在试管底部并湿润，抽真空，10 min后封口，在110℃下水解24 h，切开水解管，用去离子水全部转移到50 mL容量瓶中，定容，过滤后取滤液1 mL置于25 mL小烧杯中，在加有NaOH的真空干燥器中蒸干，加入1 mL pH 2.2的盐酸溶解后，溶液转移到样品瓶中备用。
2.3. 柱前衍生
采用Agilent 1200 HPLC自动进样器，对氨基酸标准品和样品FAA进行OPA-FMOC在线衍生。硼酸缓冲液(pH 10.4) 5 μL，邻苯二甲醛(OPA) 1 μL，洗针，氨基酸标准品或样品液1 μL，混合6次，洗针，9-芴基甲氧羰酰氯(FMOC) 1 μL，洗针，混合6次，衍生。
2.4. 色谱条件
色谱柱：Agilent AA-ODS C18 15 cm × 4.6 mm；柱温：40℃；FLD检测波长：0.00~17.50 min (λEx = 340 nm，λEm = 450 nm)，17.50~26.00 min (λEx = 266 nm，λEm = 305 nm)。流动相A：醋酸钠1.36 g，双蒸水500 μL溶解，加入三乙胺90 μL，1%~2%醋酸调pH至7.20，加入四氢呋喃1.5 μL，混匀；流动相B：醋酸钠1.36 g，双蒸水100 mL溶解，1%~2%的醋酸调pH至7.20，加至乙腈200 mL和甲醇200 mL的混合液中，混匀。
2.5. 定性与分析
以18种氨基酸标准品的保留时间定性；在氨基酸标准品9~90 pmol/μL范围内，以氨基酸浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，求得18种氨基酸的线性方程，面积归一化法计算测试样品中氨基酸的含量。
2.6. 海水中氮的分析
海水在采样后经0.45微米的膜过滤后保存，硝态氮，亚硝氮，氨氮经LACHAT 8500流动注射分析仪进行测定，总无机氮(DIN)为硝氮、亚硝氮及氨氮三项之和。
2.7. 数据的分析
采用SPSS 20.0对氨基酸数据进行分析整理。对不同站位、不同采收期条斑紫菜氨基酸数据进行多因素方差分析、相关回归及距离分析等。设显著水平为P < 0.05，极显著P < 0.01。
3. 实验结果
3.1. 氨基酸分析结果
不同站位、不同采收期的条斑紫菜共检测出18种氨基酸，结果详见表1~表5。其中，氨基酸的量变化区间为28.69~42.68 g，平均含量在2 g以上的氨基酸种类，从高至低依次有谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、共计9种；平均含量在1~2 g的氨基酸，依次为赖氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、共计5种；平均含量在1 g以下的有4种(表1~表4)。各站位、采收期条斑紫菜中的总氨基酸含量普遍具有季节性变化特点，其中海门、环渔及大丰站位样品中总氨基酸含量依月份的推迟逐步下降；北渔站位样品总氨基酸含量则出现先下降，后上升，再逐步下降的现象；连云港站位样品总氨基酸含量则随着时间的推移而缓慢上升，至3月份开始下降，且该站位条斑紫菜中总氨基酸含量除12月份低于环渔站位外，其它采收期均高于另外4个站位(图2)。
Table 1. Amino acids measurements of Phycocalidia yezoensis in position of station 1 (g/100g)
表1. 站位1样品中氨基酸的含量(g/100g)
Table 2. Amino acids measurements of Phycocalidia yezoensis in position of station 2 (g/100g)
表2. 站位2样品中氨基酸的含量(g/100g)
Table 3. Amino acids measurements of Phycocalidia yezoensis in position of station 3 (g/100g)
表3. 站位3样品中氨基酸的含量(g/100g)
Table 4. Amino acids measurements of Phycocalidia yezoensis in position of station 4 (g/100g)
表4. 站位4样品中氨基酸的含量(g/100g)
Table 5. Amino acids measurements of Phycocalidia yezoensis in position of station 5 (g/100g)
表5. 站位5样品中氨基酸的含量(g/100g)
3.2. 不同站位氨基酸差异显著性分析
对5个站位的条斑紫菜中18种氨基酸进行方差分析后发现，各站位间条斑紫菜中氨基酸有着不同的差异性，站位间不存在所有氨基酸都为显著性差异的情况。其中，海门站位与北渔站位间除酪氨酸、蛋氨酸及色氨酸外，其它15种氨基酸和总氨基酸差异为极显著；北渔站位与环渔站位间除胱氨酸外，其它17种氨基酸及总氨基酸差异极显著；环渔站位与大丰站位间除丝氨酸、组氨酸和赖氨酸外，其它15种及总氨基酸差异显著；大丰站位与连云港站位间除苏氨酸、色氨酸外，其它16种氨基酸及总氨基酸差异极显著；其它站位组间的各类氨基酸也存在着不同的差异性(见表6)。
Table 6. The amino acids differences between different positions of Phycocalidia yezoensis
表6. 站位间条斑紫菜氨基酸的差异性
注：设定P < 0.01为极显著，P < 0.05为显著。
3.3. 不同采收期条斑紫菜中氨基酸差异显著性分析
对不同采收期的样品氨基酸差异显著性分析发现，12月与4月、1月与3月、1月与4月、2月与4月采收期中的样品中18种氨基酸及总氨基酸差异均为极显著。而相邻月之间，未出现所有氨基酸组份显著性差异的情况，其中12月份与1月份之间丙氨酸和赖氨酸差异不显著；1月与2月之间缬氨酸、苯丙氨酸及异亮氨酸差异性不显著；2月与3月之间谷氨酸、酪氨酸、胱氨酸、色氨酸差异性不显著；3月与4月间胱氨酸差异性不显著。另外，天冬氨酸、丝氨酸、精氨酸及脯氨酸在各个采收期间差异均为极显著(见表7)。
Figure 2. The variation of the total amino acids in different position and harvest period
图2. 不同采收期各站位总氨基酸的变化
Table 7. The amino acids differences between different harvest period
表7. 采收期间的氨基酸差异性
3.4. 必需氨基酸的变化规律
条斑紫菜中8种必需氨基酸含量之和占总氨基酸含量的34.2%~37.4%，且在不同站位间和不同采收期中其值的变化具有一定的规律性。站位1至站位4其必需氨基酸之和基本呈现出先逐月下降的趋势，而站位5在前4个采收期呈现上升，最后1个月出现明显的下降(图3)。通过分析，发现各个采收期必需氨基酸之和呈极显著差异(P < 0.01)，而5个站位间未出现显著差异(P > 0.05)。
Figure 3. The variation of the essential amino-acid of Phycocalidia yezoensis in different position and harvest period
图3. 不同站位、不同采收期必需氨基酸的变化
3.5. 海水中总无机氮、硝态氮和氨态氮的含量
5个不同站位海水中无机氮的含量相差较大，其中大丰和连云港站位的含量较高，尤其是连云港站位的总氮、硝态氮和氨态氮都明显高于其它4个站位(图4)。
Figure 4. The content of nitrogen in different position and harvest period
图4. 不同站位、不同采收期海水中氮含量
3.6. 总无机氮、硝态氮、氨态氮与氨基酸的相关性分析
海水中总无机氮、硝态氮、氨态氮与条斑紫菜各类氨基酸的相关性分析发现，总无机氮与谷氨酸、组氨酸、苏氨酸等10种氨基酸具有明显的相关性，且与总氨基酸含量极显著相关。硝态氮也是与其中10种氨基酸具有明显相关性，与总氨基酸极显著相关，氨态氮与其中7种氨基酸具有相关性，与总氨基酸也具一定的相关性(表8)。
Table 8. The correlation of nitrogen and amino acid in Phycocalidia yezoensis
表8. 氮盐与氨基酸的相关性
注：显著*，极显著**。
4. 讨论
4.1. 条斑紫菜中氨基酸的变化规律
曾繁杰等 [16] 利用氨基酸自动分析仪对不同采收期的紫菜的氨基酸进行测定后发现，条斑紫菜和坛紫菜在不同的采收时间和剪收次数的条件下，其干紫菜中氨基酸总量为33~40克，认为其差别不明显。本文同样对紫菜进行盐酸水解后，利用液相色谱对紫菜中各种氨基酸进行测定，总氨基酸测定的结果与之相似(28.69~42.68 g)，但本文通过SPSS 20.0软件对不同采收期的条斑紫菜中紫菜的氨基酸进行分析后发现，总氨基酸含量除12月与2月份之间的无显著差别，其它采收期之间(剪收次数)均有极显著区别。其中，天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸及脯氨酸在各个站位间均极显著差异，而色氨酸在10组站位间的比较中，有6组差异不显著，表明前者4种氨基酸对于站位较为敏感，很容易受到周围环境的影响，色氨酸的合成则相对其他氨基酸稳定。在不同的采收期中，天冬氨酸、丝氨酸、精氨酸、脯氨酸在各个采收期间差异均极显著，表明以上4种氨基酸在不同的采收期中变化幅度较大。综合站位及采收期两种因素，发现天冬氨酸和脯氨酸是18种氨基酸中变化敏感的两种氨基酸。另外，条斑紫基中的必需氨基酸符合FAO制定的人类必需氨基酸的理想模式，因此条斑紫菜具有较高的营养价值，本实验中对不同站位、不同采收期条斑紫菜的必需氨基酸分析，发现其含量占总含量的34.2%~37.4%，其比例呈现较高的稳定性，表明条斑紫菜的营养价值的稳定性较高。条斑紫菜中的必需氨基酸之和分别在各个站位间和采收期中呈现不显著(P > 0.05)和极显著差异(P < 0.01)，而必需氨基酸占总氨基酸的比例却表现为不同站位间极显著差异(P < 0.01)，不同采收期不显著(P > 0.05)的特点，这个结论与曾繁杰等 [16] 认为的比例与养殖地区、采收季节无关的观点有些不同。
4.2. 氨基酸变化与不同氮源之间的关系
营养盐对藻类的采收至关重要，其中的氮盐是营养盐中最重要且需要最多者 [17] [18]。Young等 [19] 分析了不同组氮源分别对坛紫菜生长的影响，认为硝酸态氮组较之氨态和亚硝态氮的生长效果要好，这一点和Iwasaki [20] 在1967年及Chapman [21] 等在1977年的研究结果相符合，本文对氮源的相关分析中也得到了一致的结论。在海洋环境中，氮盐的种类较多，包括有机氮、无机氮，其中有机氮包括尿素和数种氨基酸，Iwasaki [20] 发现甘紫菜(Phycocalidia tenera)的丝状体不但能利用硝酸盐，还能利用一些有机氮，多种形式的氮盐共同促进紫菜的生长。本文从总无机氮、硝态氮及氨态氮与氨基酸的相关性系数(P值)分析，与氨基酸的相关性排列为总无机氮 > 硝态氮 > 氨态氮。纪明候等 [15] 对青岛三个不同氮含量的海区进行了条斑紫菜的氨基酸含量研究，认为条斑紫菜的总氨基酸及其他几种氨基酸如天冬氨酸、亮氨酸等氨基酸的含量变化与总氮含量的变化相一致。需要指出的是，纪明候等的研究实验海区以氨态氮的含量为主，硝态氮的含量较低，而本实验选取的各个站位海水中的硝态氮却明显高于氨态氮，也得出也与前者一致的结论，由此表明条斑紫菜的氨基酸含量与总无机氮的值相关性最大，而其氨基酸含量与总无机氮中硝态氮和氨态氮的组成比例相关性不大。
4.3. 合理规划紫菜适宜栽培区
条斑紫菜产业在江苏从70年代发展至今，已形成了一个栽培面积达62.2万亩，从业人员约15万人，年总产值达200亿规模的行业(省紫菜协会，2021)。尤其在连云港地区，栽培面积和密度的快速增长，导致总产量上升的同时，紫菜的品质却大打折扣。氨基酸含量是体现紫菜品质与风味的重要因素，已有研究表明紫菜中的氨基酸总量受到风浪、潮流和海水中营养物质等的影响。本研究也证明紫菜必需氨基酸的占比与其养殖海区位置有着密切关系。因而在紫菜栽培区的规划中，海区的营养盐含量与来源、海水潮流方向和海水的交换量，都是保证高品质紫菜生产的重要因素。
基金项目
项目资助：国家藻类体系，CARS-50，江苏省农业科技自主创新资金项目，CX (19) 3017，江苏现代农业产业技术体系，JATS [2020] 372。
参考文献