邻苯二甲酸二丁酯暴露下大型溞miR-34和Bcl-2基因的表达和功能分析

Expression and Function Analysis of miR-34 and Bcl-2 Gene in Daphnia magna Exposed to Dibutyl Phthalate

摘要: 本文旨在探究miR-34靶基因的功能及邻苯二甲酸二丁酯(Dinbutyl phthalate, DBP)暴露下大型溞miR-34与其靶基因Bcl-2的表达调控关系。首先利用miRbase数据库、Clustal W和MEGA7.0软件分析各物种miR-34序列的保守性；其次通过Targetscan和miRanda分析miR-34的靶基因，并运用GO和KEGG进行miR-34靶基因的功能富集分析；最后采用实时荧光定量PCR方法检测大型溞在环境浓度6 mg/L DBP暴露24 h和48 h后，大型溞miR-34及其靶基因Bcl-2的表达变化。结果显示，miR-34序列在物种进化过程中具有高度保守性，13个物种的序列有17个碱基完全一致。miR-34靶基因的GO和KEGG的功能聚类分析发现，这些靶基因参与多个信号通路，主要富集在细胞内转录调控、信号转导和胞吞作用等生物学过程中。DBP暴露48 h大型溞miR-34的相对表达水平明显上调，靶基因Bcl-2的mRNA相对表达则相反，表明大型溞miR-34与Bcl-2的负调控关系。结果提示miR-34可能在大型溞对DBP毒性作用的响应过程中发挥作用，其中miR-34可通过调控Bcl-2的表达水平来影响大型溞细胞的生命活动。这对于分析水生无脊椎动物在毒性胁迫时的调节应对机制有一定的借鉴作用。

Abstract: The purpose of this study was to investigate the function of miR-34 targeted genes and the expression and regulation relationship between miR-34 and its target gene Bcl-2 in Daphnia magna exposed to Dibutyl phthalate (DBP). Firstly, miRbase database, Clustal W and MEGA7.0 software were used to analyze the sequence conservation of miR-34 in various species. The target genes of miR-34 were analyzed by Targetscan and miRanda. The functional enrichment analysis of miR-34 target genes was performed using GO and KEGG. Finally, real-time quantitative PCR method was used to detect the expression changes of miR-34 and its target gene Bcl-2 in D. magna exposed to environmental concentration of 6 mg/L DBP for 24 h and 48 h. The results showed that the miR-34 sequence was highly conserved during species evolution. The sequences of 13 species have 17 bases identical. GO and KEGG functional clustering analysis of miR-34 target genes found that these target genes were involved in multiple signaling pathways. The main biological processes analyzed for GO enrichment are intracellular transcriptional regulation, signal transduction and endocytosis. The relative ex-pression level of miR-34 was significantly up-regulated in Daphnia magna after DBP exposure for 48 h. The relative mRNA expression of the target gene Bcl-2 was opposite. It indicated the negative regulation relationship between miR-34 and Bcl-2 in D. magna. The results suggest that miR-34 may play a role in the response of D. magna to DBP toxicity. Among them, miR-34 affects the life ac-tivities of cells by regulating the expression level of Bcl-2. This has a certain reference for studying the regulatory response mechanism of aquatic invertebrates under toxic stress.

1. 引言

邻苯二甲酸二丁酯(Dinbutyl phthalate, DBP)的广泛应用使其成为一种常见的水体有机污染物。例如近些年我国珠江河口检测到水体中DBP含量为14.8 μg/L [1]，2014年检测到长江干流江苏段的DBP含量为5.54 μg/L [2]，均超过了中国地表水环境质量标准(饮用水质量标准，GB 5749-2006)规定的地表水中该化学品的上限值(3.0 µg/L)。研究表明DBP对于水生生物具有一定的毒性作用，例如氧化损伤 [3]、生殖毒性 [4] [5]、胚胎致畸作用 [6] [7]、脂质代谢紊乱 [8] 等。课题组前期研究证实DBP对大型溞的生殖毒性及跨代效应，且对成溞和幼溞均有明显的急性毒性，氧化应激是DBP引起大型溞幼溞和成溞死亡的原因之一 [9] [10]。近年来DBP对水生生物的毒性研究受到了广泛的重视。

MicroRNA (miRNA)作为生物体内对基因表达起转录后调控作用的短链RNA，可参与在环境胁迫条件下水生生物基因信号转导通路的调节，维持有机体生命过程的稳态 [11]。例如在重金属镉的胁迫作用下，鲤鱼肾脏内的miR-155和miR-181a表达量上升，经验证miR-155与HO-1基因形成靶向关系，启动鲤鱼机体的免疫调节机制以应对镉的毒性胁迫作用 [12]。而在细菌激发或者热应激条件下，牡蛎血细胞中免疫相关的miRNA表达量有所变化，这些miRNA通过靶基因在一定程度上调节了机体细胞的氧化应激、细胞自噬和凋亡等信号途径，从而增加了牡蛎的环境适应和抗病能力 [13]。研究报道在氯吡硫磷暴露下，鲤鱼miR-731和miR-2188-3p通过靶向TLR基因，调控细胞凋亡途径，缓解了氯吡硫磷对鲤鱼机体的损伤 [14]。上述研究说明，水生动物对生物和非生物环境胁迫的响应是一个miRNA-靶基因调控网络参与的错综复杂的过程。

MiR-34作为近几年研究比较广泛的miRNA之一，主要的研究仍然集中在哺乳动物之中，例如小鼠的内皮祖细胞中miR-34的表达变化参与了新生血管的调节 [15]，以及miR-34在人体胶质瘤、结直肠癌、骨肉瘤等肿瘤生物学的研究内容越加丰富 [16] [17] [18]。B淋巴细胞瘤2基因(Bcl-2)是miR-34的靶基因之一，在机体细胞的生命活动中如细胞死亡、生长和发育、非生物和生物应激反应中的起到关键作用 [19] [20]。Bcl-2作为细胞凋亡家族中的一员，具有抗凋亡作用，其高表达可以抑制细胞凋亡，反之其低表达可以促进细胞凋亡 [21]。细胞凋亡对于生物在环境胁迫响应过程中机体稳态和生理活动的维持至关重要，例如低氧胁迫降低了鲢心肌细胞中的Bcl-2表达，导致心肌细胞凋亡，造成心脏损伤甚至个体死亡；急性高温胁迫48 h后大口黑鲈幼鱼肝脏中Bcl-2表达量仅为对照组的0.04倍，造成细胞凋亡和一定程度的细胞坏死 [22] [23] [24]。

然而，环境应激条件下，在水生动物中miR-34是否可以通过调控靶基因Bcl-2的表达，影响机体的胁迫响应机制还未见报道。本研究对物种间miR-34序列的保守性及其靶基因功能进行分析，并对miR-34在DBP暴露下大型溞胁迫响应中的功能进行了初步探究，以揭示大型溞miR-34和Bcl-2基因在污染物毒性胁迫响应中的部分机制。

2. 材料与方法

2.1. 大型溞的培养和药物处理

实验所用的大型溞来自于山东省大汶河，在辽宁省水生生物重点实验室培养。实验选取一只雌溞，将雌溞孤雌生殖的首批幼溞以密度为30 ± 5只/L继续培养，得到足够数量的同步溞用于后续实验。使用溶解氧为7.96 ± 0.5 mg/L，培养液用pH为7.80 ± 0.2的脱氯自来水，投喂密度为3~4 × 10⁵ cells/mL的栅藻作为饵料。

设置DBP浓度为6 mg/L的药物处理组和对照组，每组设置4个重复，每个重复在1000 mL烧杯中放入100只大型溞。实验过程中不投喂，以确保实验条件的稳定。24 h和48 h后将存活的大型溞分别放入1.5 ml离心管中，迅速用针管将里面的水分吸干。将离心管保存后用于后续实验分析。

2.2. miR-34序列的保守性分析

大型溞miR-34序列来自于课题组前期DBP暴露下大型溞miRNA表达谱测序数据，其序列为UGGCAGUGUGGUUAGCUGGUUGU。在miRbase数据库(http://mirbase.org/)中获得十二种生物(蚤状溞、海蠕虫、文昌鱼、果蝇、斑马鱼、非洲爪蟾、马、白唇柽柳猴、山羊、原鸽、小鼠、人类)的miR-34序列，将大型溞等13个物种的miR-34序列利用MEGA7.0软件的Cluster W算法进行多序列比对。

2.3. miR-34靶基因预测和富集分析

采用TargetScan和miRanda在线工具对miR-34进行靶基因分析，设置限定条件，在TargetScan算法中去除得分(context score percentile)小于50的靶基因，在miRanda算法中去除最大自由能(Max Energy)大于-10的靶基因。取两款软件数据的交集作为最终确定的靶基因范围。

应用GO生物数据库对miR-34靶基因集合进行功能注释，经显著性分析，得到具有统计学意义的GO术语富集分析结果。利用KEGG数据库对于miR-34的靶基因集合进行代谢途径的通路富集分析，可以呈现基因的代谢途径和催化过程中反应酶的注解。通过统计分析具有差异的p值，得到具有统计学意义的KEGG信号通路信息。

2.4. qPCR

总RNA的提取方式是按照MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒(宝生物工程大连有限公司)对样品进行匀浆、消化、离心、洗脱等操作，并检测RNA的浓度和质量水平。采用Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR试剂盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司)对大型溞的总RNA进行反转录，得到cDNA。miR-34采用miRNA 1st strand cDNA synthesis kit试剂盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司)进行反转录分析。

miR-34的靶基因Bcl-2在NCBI中的序列号为：LOC116929975。运用NCBI-Primer设计特异性引物，miR-34的内参基因为U6 [25]，基因编号为LOC116922842；Bcl-2的内参基因为Beta-actin [26]，基因编号为LOC116919128。引物设计见表1，序列由生工生物工程(上海)完成。

Table 1. qPCR primer sequences

表1. qPCR引物序列

miR-34和Bcl-2的相对表达采用艾科瑞生物SYBR® Green Premix Pro Taq HS q-PCR Kit II (Rox Plus) (湖南)进行检测。用2^–ΔΔCt法分析大型溞miR-34和Bcl-2基因的相对表达量。

2.5. 数据处理

使用Excel (T-test检验)、SPSS 17.0 (one-way ANOVA)对所取得的数据进行显著性分析，基因表达量显著性范围设为0.05，差异极其显著为0.01 (用**表示)。

3. 结果

3.1. miR-34序列的保守性分析

大型溞和从miRbase数据库获得蚤状溞、海蠕虫、文昌鱼、果蝇、斑马鱼、非洲爪蟾、马、白唇柽柳猴、山羊、原鸽、小鼠、人类等13个物种的miR-34的序列见表2。miR-34对靶基因的作用是通过miR-34序列的5'端种子序列(第2-8核苷酸)与靶基因mRNA的3' UTR区进行碱基配对来完成的，表2中黄色标记部分即各个物种miR-34的种子序列。

采用MEGA7.0的Cluster W算法对大型溞等13个物种的miR-34的序列进行了多序列比对，结果显示在大型溞中miR-34序列长度为23 bp，而其他十二种生物的miR-34序列长度为22 bp到25 bp不等，且13个物种的序列有17个碱基完全一致(图1)，说明miR-34基因在生物进化过程中具有高度保守性。

Table 2. Mature sequences of miR-34 in thirteen species

表2. 13个物种中miR-34的成熟序列

Figure 1. Alignment analysis of miR-34 mature sequences in thirteen species

图1. 13种物种中miR-34成熟序列的多序列比对

3.2. miR-34靶基因富集分析

通过Targetscan和miRanda在线软件对miR-34进行靶基因预测，将二者获得的靶基因取交集，最终得到616个miR-34的靶基因。我们利用GO数据库对收集到的616个靶基因进行了生物学过程、亚细胞定位和分子功能三个方面的GO的注释，结果共得到了1416条GO的注释信息。如图2(A)所示，miR-34靶基因参与的生物学过程主要有转录调控、DNA模板化、信号转导和胞内信号转导等方面；大部分基因的亚细胞定位于细胞膜或质膜；分子功能主要集中在蛋白结合、核苷酸结合和ATP结合三个方面。

利用KEGG经典通路数据库，得到的616条靶基因共富集到112条信号通路中。将结果以散点图的形式呈现(图2(B))，通过Rich factor、P value和富集在同一条通路上的基因个数衡量KEGG富集程度。Rich Factor是KEGG的富集因子，点的大小越大，富集度越高。点的颜色代表不同的P value值，数值越小，富集越显著。miR-34靶基因在胞吞作用(Endocytosis)、叶酸生物合成(Folate biosynthesis)、丁酸代谢(Butanoate metabolism)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)和P53信号通路(p53 signaling pathway)中的富集程度最高。

3.3. DBP暴露下大型溞miR-34与Bcl-2基因的表达分析

将大型溞置于环境浓度的6 mg/L DBP中暴露24 h，与对照组相比，miR-34的表达量显著下调(p = 0.011) (图3(A))；而暴露48 h，miR-34的表达量显著上调(p = 0.016)，且其表达水平明显高于对照组和24 h组。将大型溞暴露于6 mg/L DBP 24 h后，与对照组相比，Bcl-2基因的mRNA表达量下降，继续暴露到48 h后，Bcl-2的mRNA表达量极显著下调(p = 0.007) (图3(B))。

Figure 2. Gene enrichment analysis of target genes of miR-34 (A: GO annotation; B: KEGG pathway)

图2. miR-34靶基因的功能富集分析(A：GO的注释；B：KEGG信号通路)

Figure 3. qPCR analysis of miR-34 and Bcl-2 expression levels in Daphnia magna exposed to DBP (A: Expression of miR-34; B: Expression of Bcl-2)

图3. DBP暴露下大型溞miR-34和靶基因Bcl-2的相对表达量(A：miR-34的相对表达量；B：Bcl-2的相对表达量)

4. 讨论

近年随着DBP的广泛使用，严重污染环境，DBP可通过不同途径进入水体，对水生生物的健康造成威胁 [27] [28]。大型溞处于水生食物链的关键环节，水体中有机污染物可通过大型溞传递到更高营养级生物体内，对其造成危害。迄今对大型溞处于典型重金属和有机污染物暴露条件下生理生化反应和基因转录等研究较为普遍 [29]，但是对DBP胁迫下大型溞miRNA的研究尚未涉及。MiRNA作为一种生物体内重要的非编码短链RNA，在进化过程中通常高度保守，通过靶向作用于mRNA来影响翻译进程，从而在翻译水平上调控基因表达，并调控机体的有序运转 [30]。miRNA在水生生物生长、发育、死亡和胁迫应答中发挥调控作用 [12] [13] [14]。

miRNA是通过调控靶基因的表达来影响细胞生命活动，找到miR-34的靶基因是研究其在水生动物中生物学功能的关键。为了探讨miR-34在DBP胁迫大型溞中的作用机制，我们首先进行了miR-34的保守性和靶基因的功能富集分析。本文将大型溞的miR-34序列，与miRbase中的十二种生物的miR-34进行多序列比对，通过MEGA7.0中Clustal W算法分析表明各物种miR-34的碱基序列大部分完全一致(图1)，说明从无脊椎动物到哺乳动物的进化过程中，miR-34的保守性比较高。MiR-34首次发现是在2011年对线虫的研究中 [18]，后来在多种生物中发现了miR-34的存在。MiR-34序列十分保守，在无脊椎动物中仅有一种miR-34，而在脊椎动物中存在miR-34基因家族 [31]。研究发现miR-34和其他的miRNA基因家族类似，从低等生物到高等动物均具有单一保守的同源序列，但因为有串联的局部重复和串联重复，从而在脊椎动物中形成了基因家族 [32]。

我们对miR-34进行靶基因分析，共获得616个靶基因，其中包括已经在多种生物中经过双荧光素酶实验验证的Notch、Bcl-2和TGF基因等 [33] [34] [35] [36]。经过GO和KEGG的注释分析，发现miR-34靶基因的生物学功能主要与信号转导方面密切相关(图2(A))，而信号通路则主要富集在胞吞作用、叶酸和丁酸的代谢、MAPK和P53信号通路上(图2(B))。在对于哺乳动物的研究中，发现miR-34对于细胞的增殖和凋亡有着重要的调控作用，特别是针对肿瘤细胞，例如miR-34通过靶基因Notch1调控子宫内膜癌细胞的增殖和凋亡 [37]。而P53基因可以调控miR-34的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，激活肿瘤细胞的凋亡 [38]。据此，我们推测，大型溞体内的miR-34基因也可能通过影响机体的物质代谢过程、胞吞作用以及MAPK和P53等信号通路，启动或者抑制细胞凋亡途径，调控细胞的增殖过程，参与到大型溞的重要生命活动过程中。

我们通过对暴露6 mg/L DBP 24 h和48 h大型溞miR-34和靶基因Bcl-2的检测，发现DBP显著干扰了大型溞miR-34和细胞增殖及凋亡相关基因Bcl-2的表达。在环境浓度6 mg/L的DBP暴露后，大型溞体内的miR-34相对表达水平明显上调(图3(A))，表明miR-34可能在大型溞对DBP毒性作用的响应过程中发挥作用。已有实验证明在病毒侵染条件下的虾的miR-34表达水平明显改变，说明miR-34对环境应激有明显的响应作用 [39]。Bcl-2是细胞凋亡信号通路上的重要基因之一 [21]，具有抗凋亡的作用，能抑制细胞凋亡 [40]，是生物机体内维持生存平衡的重要基因 [41]。而大型溞Bcl-2 mRNA在6 mg/L DBP暴露下的相对表达量明显下调(图3(B))，推测DBP可能会通过细胞凋亡对大型溞造成毒性效应。冷应激会改变黑鲷中Bcl-2的表达水平，使凋亡基因表达比例失调，增加了细胞凋亡，使组织结构受损；草鱼在镉暴露条件下，Bcl-2表达量明显上调，抑制细胞凋亡，说明Bcl-2在草鱼应对镉胁迫的过程中发挥了一定的作用 [42] [43]。我们发现，大型溞在DBP暴露下miR-34高表达，而Bcl-2的mRNA持续低表达，表明大型溞miR-34与Bcl-2的负调控关系。DBP对大型溞的毒性作用可能是通过miR-34的表达变化靶向介导Bcl-2基因mRNA的表达水平，调控细胞凋亡过程，进而破坏大型溞的正常生命活动。

综上所述，通过对miR-34靶基因的功能富集分析，发现miR-34可能参与大型溞机体细胞内一系列生物学过程和相关基因的调控，如物质代谢、信号转导、胞吞作用等；qPCR检测发现DBP暴露会影响大型溞miR-34和Bcl-2的异常表达，推测DBP的致毒效应部分是与大型溞miR-34和Bcl-2信号轴细胞信号转导失调相关，导致Bcl-2基因参与的细胞凋亡等生命活动紊乱。本实验以期为枝角类生物响应污染物胁迫的机制分析提供基础数据。

基金项目

本论文由国家自然科学基金(42077226)和辽宁省自然科学基金(20180550774)资助。

NOTES

^*通讯作者。