棘胸蛙腐皮症病原菌的鉴定及疫苗免疫效果研究

Identification of Pathogen of Skin Rot of Rana spinosa and Study on Immune Effect of Vaccine

摘要: 为确定棘胸蛙(Quasipaa spinosa)腐皮病的病原，并为生产中防治该病提供理论依据，本研究从病蛙病灶处分离病原菌，进行人工感染和病原菌的形态特征、理化特性及分子生物学分析，同时开展药敏试验和疫苗免疫防治试验。结果表明，从患病棘胸蛙病灶处分离得到的优势菌QS01，通过人工回归感染试验证实该菌为棘胸蛙腐皮病的病原菌，结合其表型特征及16S rRNA、gyrB基因序列分析判定为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)。药敏试验结果显示，该菌对恩诺沙星、氯霉素和头孢他啶等8种抗生素敏感，而对其他抗生素敏感度低或具有一定的抗性。采用注射、浸泡和喷雾方式给蛙接种QS01甲醛灭活疫苗，三组的平均效价均于第20 d时达到峰值，血清抗体效价最高分别为1:64~128 (101.6)、1:16~32 (20.2)和1:16~32 (16)，明显高于对照组，经攻毒后免疫保护率分别达到100%、85.71%和71.43%。试验发现弗氏柠檬酸杆菌可感染棘胸蛙导致其腐皮病，使用疫苗对此病的防治是有效可行的。

Abstract: In order to determine the pathogen of the skin rot disease of Rana spinosa and provide theoretical basis for the prevention and control of the disease in production, this study isolated the pathogenic bacteria from the diseased frog focus, carried out artificial infection and the morphological characteristics, physical and chemical characteristics and molecular biological analysis of the pathogenic bacteria, and carried out drug sensitivity test and vaccine immunity and control test. The results showed that the dominant bacteria QS01 isolated from the diseased lesions of Rana spinosa was confirmed to be the pathogen of skin rot disease of Rana spinosa by artificial regression infection test. Combined with its phenotypic characteristics and 16S rRNA, gyrB gene sequence analysis, it was determined to be Citrobacter freundii. The medicine sensitive test result showed that the bacteria is sensitive to eight kinds of antibiotics including Enrofloxacin, Chloramphenicol, Ceftazidimeetc, but lowly sensitive or resistant to other tested antimicrobial agents. Adopting these ways included injection, immersion and atomizing to inoculate frog with vaccine named QS01 inactivated by formaldehyde, average titer of three immunity groups reached the peak in the 20 d. The highest serum antibody titers were 1:64~128 (101.6), 1:16~32 (20.2) and 1:16~32 (16), which were significantly higher than those of the control group. The immune protection rate for Q. spinosa after injection, immersion and spray of QS01 inactivated vaccine can reach 100%, 85.71% and 71.43%. Our research shows that Citrobacter frederii is the pathogen of skin rot disease of Rana spinosa, and it is effective and feasible to use vaccine to control ulcerative skin disease.

1. 引言

棘胸蛙(Quasipaa spinosa)俗称“石蛙”隶属于蛙科、棘蛙属，因雄蛙胸部具有棘刺而得名，主要分布于我国湖南、江西、浙江、福建和香港等地和越南北部 [1] ，因其肉质鲜美，兼具滋补和药用价值，目前市场需求旺盛，价格不断攀升。由于棘胸蛙作为一种典型的溪源性大型无尾两栖类，其生物学特性决定了该物种对生境的要求非常苛刻，溪水仿生态养殖是棘胸蛙养殖的主要模式 [2] 。近年来，随着养殖规模的扩大，发生病害的频率不断升高，细菌耐药问题日趋明显，严重制约了棘胸蛙养殖产业的发展。

腐皮病(或烂皮病)是棘胸蛙等经济蛙类最为常见的疾病之一，且病原种类较多 [3] - [11] ，可以导致动物的大量死亡，即便治愈也会严重影响水产品的商品价值。按病因该病症可分为营养型和病原型腐皮病。前者因饲料单一、机体缺乏某些维生素或微量元素导致的皮肤溃烂 [12] ，继而诱发细菌感染，可通过补充营养素来防治此症；后者由细菌或病毒感染直接引起，尤其在高密度养殖条件下传染力更强、致死率更高。在养殖实践中，仅凭症状很难确定病因，治疗中经常出现抗生素滥用现象，因此亟待开发专用疫苗等绿色防控技术。近期，浙江丽水地区棘胸蛙养殖蛙场内先后出现大规模腐皮病爆发，本实验室对致病菌株进行了分离鉴定，并发现该菌株在耐药性等方面与浙江金华地区分离的菌株 [13] 存在一定差异，并且通过制备甲醛灭活疫苗研究了不同接种方式对疫苗免疫保护效果的影响，以期开发一种实用性的免疫防治技术，从而提高我国蛙类无公害养殖的技术水平，促进这一特色水产养殖业的可持续发展。

2. 材料与方法

2.1. 实验材料

患腐皮病棘胸蛙收集自浙江丽水地区养殖场，健康棘胸蛙(40 ± 5 g)亦来自该养殖场，饲养于水族箱(70 cm × 53 cm × 57 cm)内，提供充足的水陆环境和遮蔽物，以黄粉虫(Tenebrio molitor)活体作为饵料，每日投喂一次，驯化一周后用于后续研究。

2.2. 病原分离

在无菌条件下，取患病棘胸蛙体表病灶、肝脏等组织少许，使用无菌玻璃匀浆器研磨，经稀释后涂布于营养琼脂培养基，28℃培养24 h后肉眼观察菌落形态、大小、隆起度、颜色等，挑取优势单菌落接种于绵羊血琼脂培养基，28℃摇床恒温培养24 h后，观察菌落生长和溶血情况，将具有溶血性的单菌落转移至胰酪大豆胨琼脂培养基，继续进行28℃纯化培养。将分离纯化得到的1个菌株命名为QS01。

2.3. 回归感染试验

将筛选出的菌株接种于TSA平板上，28℃培养24 h，用0.65%的无菌生理盐水洗下菌苔制成菌悬液，稀释得到浓度为1.0 × 10⁹ CFU/mL的菌悬液。试验采用肌肉注射法，选取健康棘胸蛙随机分两组(10只/组)，感染组每只注射菌悬液0.2 mL，对照组每只注射同剂量的0.65%无菌生理盐水。连续观察记录15 d内的发病症状和死亡情况，并对濒临死亡的个体病原进行再次细菌分离与鉴定。

2.4. 病原菌鉴定

2.4.1. 形态观察及理化特性鉴定

将供试菌接种于胰酪大豆胨琼脂培养基，28℃培养24 h观察菌落特征，按常规方法进行革兰氏染色和显微观察。将供试菌株接种于细菌微量生化鉴定管中进行理化特性鉴定。细菌微量生化鉴定管购自杭州天和微生物试剂有限公司。细菌各项生理生化指标的鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》 [14] 和《伯杰氏细菌鉴定手册》 [15] (第九版)中的方法进行。

2.4.2. 病原菌分子生物学鉴定

按细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)所述方法提取DNA作为PCR模板DNA，−20℃保存备用。细菌16S rRNA引物 [16] 为F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，M = A/C，R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。gyrB引物 [17] 为F：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNG GNGGNAARTTYGA-3′，R：5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCN GTCAT-3′。在20 μL反应体系中：2 × Es Taq MasterMix (Es Taq DNA Polymerase，2 × Es Taq PCR Buffer，3 mMMgCl2和400 μM dNTP mix) 10 μL，引物各1 μL，Template DNA 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反应程序为：94℃预变性4 min，94℃变性1 min、56℃复性45 s、72℃延伸2 min、30个循环，然后72℃温育10 min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，由上海生物工程技术公司进行测序。获得的16S rRNA和gyrB基因序列通过NCBI的BLAST检索系统进行序列同源性分析，从GenBank数据库中获得相似性较高的序列，使用MEGA X软件，采用邻接法(Neighbor-Joining, NJ) [18] 构建16S rRNA、gyrB基因系统进化树，并通过1000次的自举分析(Bootstrap)进行置信度检测。

2.5. 药物敏感试验

采用常规琼脂扩散(K-B)法进行常用抗菌药物的敏感性测定 [19] ，选用氯霉素、头孢拉定和恩诺沙星等20种药敏纸片进行试验，测定其抑菌圈直径(平行重复3次)，直径小于10 mm为不敏感或低度敏感，10~15 mm为中度敏感，大于15 mm为高度敏感。药敏试纸购自杭州天和微生物试剂有限公司。

2.6. 免疫防治试验

甲醛灭活法制备浓度为1.0 × 10⁹ CFU/mL的疫苗，用平板涂布法和肌肉注射法攻毒试验来检测疫苗的安全性。试验分注射组、浸泡组、喷雾组和对照组(20只/组)。注射组为每只肌肉注射1.0 × 10⁹ CFU/mL的疫苗0.2 mL；浸泡组为连续3 d每天用2.0%的1.0 × 10⁹ CFU/mL疫苗浸泡30 min；喷雾组为连续3 d每天喷1.0 × 10⁹ CFU/mL的疫苗于蛙体30 min；对照组为每只肌肉注射0.2 mL的0.65%无菌生理盐水。免疫中第0 d，10 d，20 d，30 d，每组随机取3只蛙制备血清，用96孔U型板测定平均凝集抗体效价 [20] ，抗原为1.0 × 10⁹ CFU/mL的活菌，抗体为免疫血清。在35℃条件下孵育1 h，再置于4℃冰箱中过夜，翌晨判定其结果。免疫第30 d后，以1.0 × 10⁹ CFU/mL的活病原菌进行攻毒，连续观察15 d记录发病症状及死亡情况。相对免疫保护率(Relative percentage of survival, RPS)：RPS (%) = (1 − 免疫组死亡率/对照组死亡率) × 100%。

3. 结果

3.1. 细菌的分离及回归感染实验

从病蛙病灶部位中分离出的一株致病菌(QS01)，回归感染实验表明菌株对棘胸蛙有较强的致病性，感染组棘胸蛙死亡率高达90%，对照组无死亡(图1)。部分感染组棘胸蛙的头部和背部皮肤出现白斑，直至溃烂，而且活动能力降低，食欲减退，解剖后发现其胃肠道无食，充满粘液，肝呈土灰色，该症状与养殖场发病棘胸蛙相同。

Figure 1. Challenge test of the isolated strain QS01 by muscle injection

图1. 分离菌QS01人工感染试验

3.2. 形态与生理生化特征

从病蛙身上分离得到的病原菌QS01直径1~2 mm、圆形、边缘整齐，为隆起和光滑湿润的灰白色半透明菌落，理化特性见表1。挑取单菌落，经革兰氏染色后镜检，发现该菌株为革兰氏阴性菌，呈杆状。

Table 1. Morphological, physical and biochemical characteristics of isolated strain QS01

表1. 分离株QS01的形态、生理生化指标

注：−，阴性；+，阳性；d，10%~90%阳性；F，发酵型；·，原文中无记载。

3.3. 16S rRNA、gyrB基因序列分析与系统进化树构建

对QS01菌株进行了16S rRNA和gyrB基因序列的测定，PCR扩增产物电泳结果(图2)。

Figure 2. PCR amplified products of 16S rRNA, gyrB genes of strain QS01. M: DM 2000; 1: Amplified products of 16S rRNA; 2: Amplified products of gyrB; 3: Control

图2. 菌株QS01的16S rRNA、gyrB基因PCR扩增产物。M：DM 2000；1：16S rRNA基因扩增产物；2：gyrB基因扩增产物；3：空白对照

分离菌QS01所扩增的16S rRNA 基因序列长度为1441 bp，将分离菌所扩增的16S rRNA基因序列进行同源性分析，结果均与枸橼酸杆菌属(Citrobacter)细菌的16S rRNA基因序列自然聚类，QS01菌株与在检索出的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii) (登录号DQ010114.1)相似性最近，为99% (图3)。

Figure 3. Phylogenetic tree based on QS01 16S rRNA gene sequences

图3. 菌株QS01的16S rRNA基因序列系统进化树

分离菌QS01所扩增的gyrB基因序列长度为1178 bp，将菌株所扩增的gyrB基因序列进行同源性分析，分离株与弗氏柠檬酸杆菌(登录号AJ300528.1)聚为一支，同源性为96% (图4)。

Figure 4. Phylogenetic tree based on QS01gyrB gene sequences

图4. 菌株QS01的gyrB基因序列系统进化树

综合菌株QS01的表型特征、理化特性及16SrRNA和gyrB基因序列的系统发育分析结果，判定分离菌为枸橼酸杆菌属的弗氏柠檬酸杆菌。

3.4. 药物敏感试验

病原菌QS01的抗生素药敏结果如表2所示，在检测的20种抗生素中，菌株QS01对氯霉素、恩诺沙星和头孢他啶等8种抗生素敏感，对链霉素、庆大霉素和呋喃妥因等6种抗生素中度敏感，而对青霉素、头孢拉定和利福平等6种抗生素具有一定的抗性。

Table 2. The results of the antibiotics sensitivity test

表2. 抗生素类药敏试验结果

注：R. 耐药；I. 中度敏感；S. 敏感。^*Are allowed to be applied to nuisanceless aquaculture in China.

3.5. 药敏试验结果比较

棘胸蛙与其他水产生物来源的弗氏柠檬酸杆菌的药敏比较结果表明(表3)，该菌对喹诺酮类、呋喃类、氨基糖苷类和酰胺醇类抗生素较为敏感，青霉素和利福平耐药。

Table 3. Comparative analysis of antibiotic susceptibility test results

表3. 药敏试验结果比较分析

注：R. 耐药；I. 中度敏感；S. 敏感；−. 其他研究中没有试验的抗生素。

3.6. 免疫保护效果

将疫苗涂布于LB平板培养16~24 h后，培养基上均无细菌生长，表明已彻底灭活，同时肌肉注射结果表明，所有注射疫苗和生理盐水的健康棘胸蛙在15 d内均活动正常，进一步说明该疫苗对棘胸蛙是安全的。棘胸蛙在接种疫苗后，血清的凝集抗体效价逐渐上升，三个免疫组平均效价于第20 d时达到峰值，注射免疫的血清抗体效价最高1:64~128 (101.6)，浸泡免疫和喷雾免疫分别为1:16~32 (20.2)，1:16~32 (16)，并一直持续到第30 d，而未免疫的对照组血清抗体效价只有1:2~2 (2) (表4)。

Table 4. Serum agglutinating antibody titers

表4. 血清凝集抗体效价

活菌攻毒试验表明，免疫组蛙体都具有一定的抗病力，注射组能够为免疫棘胸蛙提供良好的保护，其免疫保护率高达100%，浸泡和喷雾免疫组免疫保护率分别为85.71%和71.43%，其中注射组的免疫保护力最高，浸泡和喷雾组次之(表5)。

Table 5. Effect of different inoculation methods on immune protection rate after live bacteria challenge

表5. 不同接种方式对活菌攻毒后免疫保护率的影响

4. 讨论

4.1. 病原菌的鉴定

腐皮症或烂皮病主要表现为皮肤溃烂和出现白斑，甚至出现病灶部位肌肉暴露的现象，可能导致大量死亡，并严重影响水产动物的商品价值。根据相关研究报道，多种致病菌均可引起蛙类的腐皮症。如可导致牛蛙腐皮症的细菌包括感染奇异变形杆菌(Proteus mirabilis) [3] [4] 、克氏耶尔森氏菌(Yersinia kristensenii) [3] 、鲁克氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri) [4] 和海洋分枝杆菌(Mycobacterium marinum) [5] 、弗氏柠檬酸杆菌 [22] 均可导致皮肤溃烂的症状。在模式物种中，非洲爪蟾(Xenopus laevis)腐皮病可由龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae) [6] 和Mycobacterium liflandii [7] ，而热带爪蟾(Xenopus tropicalis)腐皮病可由溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans) [8] 和斯氏分枝杆菌(Mycobacterium szulgai) [9] 引起。又如嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和布兰汉氏球菌(Branhamella sp.) [10] 是导致美国青蛙(Rana grylio)腐皮症的致病菌。关于引起棘胸蛙烂皮病的病原也有相关报道。如吕耀平等 [26] 在患烂皮病的棘胸蛙中筛选得到的病株名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。本实验室曾在浙江金华地区棘胸蛙养殖场分离到三株烂皮病菌株，两株为弗氏柠檬酸杆菌(LJ10201和LJ10203)，一株为布氏柠檬酸杆菌(LJ10202) [13] 。在本研究获得的菌株QS01来自浙江丽水地区养殖场，首先对该菌株进行了回归感染实验，并对从形态、生理生化和基因层面进行了鉴定，本研究同时采用16SrRNA和和gyrB基因对该菌株进行了分子鉴定。16SrRNA基因是细菌鉴定、分类及系统发育分析研究中最常用、最有效的“分子钟” [27] [28] [29] ，但由于其自身的局限性，在有些情况下只能对细菌进行属水平的鉴定。与16SrRNA基因相比，蛋白编码基因gyrB基因是用于细菌鉴定和分类的又一理想的靶基因，具有进化速率较快、碱基替换频率高等优点，可以用于细菌种水平的鉴定 [30] 。因此，经过这两种基因检验进一步提高了细菌鉴定的准确性，最后判定该致病菌为弗氏柠檬酸杆菌。弗氏柠檬酸杆菌隶属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)枸橼酸杆菌属(Citrobacter)。该菌革兰氏阴性，需氧或兼性厌氧，为条件致病菌，广泛存在于自然界中，可感染多种水产动物并导致大量死亡。在两栖类中已报道该菌可感染大鲵 [22] [31] ，症状表现为头部和腹部肿大、表皮溃烂。感染弗氏柠檬酸杆菌的牛蛙 [23] 表现为皮下形成囊泡，厌食、皮肤充血和皮肤溃烂，这与研究棘胸蛙腐皮病的症状较为类似。

4.2. 耐药性分析

本研究对浙江丽水地区养殖场患腐皮病棘胸蛙体内分离出的弗氏柠檬酸杆菌QS01菌株进行药敏实验，发现该菌株对氯霉素、四环素、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、头孢他啶敏感，而对青霉素、头孢拉定、万古霉素、卡那霉素和利福平6种抗生素表现出耐药性。然而，在浙江金华地区分离出的菌株对链霉素、庆大霉素、新霉素、卡那霉素、头孢他啶敏感，而对氯霉素、青霉素、头孢拉定、万古霉素、利福平具有耐药性 [13] (如表3)。这两株菌均对青霉素、头孢拉定、万古霉素、利福平表现出耐药性，仅对恩诺沙星和头孢他啶共同表现出敏感性，说明这两株菌在耐药性方面存在较大差异。在其他两栖类种，患病大鲵 [22] 体内分离出的弗氏柠檬酸杆菌对呋喃妥因和头孢他啶敏感，而引起牛蛙 [22] 腐皮病的弗氏柠檬酸杆菌对庆大霉素、新霉素、恩诺沙星敏感。因此，由同一种细菌病原引起的腐皮病难以采用同种抗生素进行治疗，这无疑增加了诊治难度，同时也是导致细菌耐药和抗生素滥用问题的主要原因。

4.3. 疫苗免疫保护效果

目前，养殖蛙类细菌多重耐药性和药物残留问题已经引起了人们对食品安全的担忧，利用免疫学方法预防细菌性疾病可以有效减少抗生素使用和缓解细菌耐药性问题。然而，疫苗接种方式是否具有操作性是亟待解决的问题。如采用注射方式费时费力，会给从业人员带来巨大的经济和劳动负担，因此这种疫苗接种方式难以推广。周永灿等 [32] 报道了虎纹蛙(Rana rugulosa)白内障脑膜炎败血黄杆菌(Flavobac- terium meningitidis)灭活疫苗不同接种方式的免疫效果，结果表明肌肉注射法免疫效果最好，其最高凝集抗体效价达426.7，喷雾法次之，而口服法的凝集抗体效价相对最低，在接种疫苗第5周进行攻毒后，注射和喷雾免疫的虎纹蛙成活率均在95%以上，而口服免疫组的成活率则只有35%。本研究采用了肌肉注射法、浸泡法、喷雾法对棘胸蛙进行免疫，发现三种接种方式血清凝集抗体效价逐渐上升，均于第20 d时达到峰值，注射免疫的血清抗体效价最高1:64~128 (101.6)，浸泡免疫和喷雾免疫分别为1:16~32 (20.2)，1:16~32 (16)，并一直持续到第30 d，而未对照组血清抗体效价只有1:2~2 (2)，其中肌肉注射法免疫效果最佳，免疫保护率高达100%，浸泡法略优于喷雾法，免疫保护率分别为85.71%和71.43%，这与上述对牛蛙的研究结果较为一致。然而，周末等 [33] 研究了嗜水气单胞菌疫苗不同接种方式对中国林蛙(Rana chensinensis)免疫效果，结果表明浸泡组、腹腔注射组和口服组均在免疫40 d后血清凝集抗体效价达到最高，分别为26、25、27，而肌肉注射组在免疫30~40 d达到最高为23，口服和浸泡免疫组分别71%和76%，腹腔注射组和肌肉注射组的免疫保护力仅为59%和47%。导致这种差异的原因尚不清楚，有待深入研究。从经济性和可操作性角度来看，利用浸泡法免疫棘胸蛙是相对实用的接种方式。

5. 结论

本试验确定了弗氏柠檬酸杆菌是导致本次试验中棘胸蛙烂皮病的病原菌，该菌感染后会造成棘胸蛙烂皮部分肌肉糜烂，组织渗出坏死，出现严重的炎症反应最终导致死亡。该病原对8种抗生素敏感，对6种抗生素呈现出耐药性，本研究研制的疫苗对减少抗生素的使用具有积极意义，通过浸泡的方法具有较高的免疫保护率，为蛙类疾病疫苗的研究和使用提供科学依据。

NOTES

^*通讯作者。