弥漫性大B细胞淋巴瘤化疗后外周血T细胞亚群的动态变化

Dynamic Changes in Peripheral Blood T-Cell Subset after Immunochemotherapy Treatment in Diffuse Large B-Cell Lymphoma

摘要: 引言：弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)患者体内T淋巴细胞亚群的转化和分布与疾病进展有关。CD4⁺T细胞亚群在体内启动和调节抗淋巴瘤免疫应答中的作用仍有争议。方法：我们回顾性分析了31例DLBCL患者的临床资料，他们接受了六个周期的一线治疗方案，即利妥昔单抗联合环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙(R-CHOP)。我们分别在诊断和治疗后收集了这些患者的外周血样本，循环淋巴细胞亚群的百分比由定量流式细胞术分析得出。结果：我们记录了Th1细胞的逐渐增加，这在T3时是显著的，Th2和Treg细胞的减少一直维持到R-CHOP治疗的T3时期。两个周期的治疗已经诱导Th1/Th2比率显著增长，并从那时起持续增加。我们发现基线和T3时Th1/Th2比值与达到完全缓解(Complete Response, CR)之间存在显著相关性。Th1细胞百分比与CR实现之间存在相关性，Th1细胞的临界值为43.09。结论：我们认为，在新诊断的患者中，R-CHOP可能通过抑制Th2的扩增来改变Th1/Th2比值的转化，这表明在治疗期间T细胞极化从促肿瘤T细胞应答强烈转变为抗肿瘤T细胞反应。

Abstract: Introduction: The transformation and distribution of specific T-cell subsets in diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) patients are connected with disease progression. The role of CD4⁺T cell subsets in initiating and regulating anti-lymphoma immune response in vivo remains controversial. Meth-ods: We retrospectively analyzed the clinical data of 31 patients diagnosed with DLBCL who under-went six cycles of rituximab-cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine and prednisolone (R-CHOP) chemotherapy or more, serving as the first-line therapy. We collected peripheral blood samples from these patients at diagnosis and post-treatment, and analyzed the percentages of circulating lymphocyte subsets by quantitative flow cytometry. Results: We documented a progressive in-crease of Th1 cells, which was significant at T3, and a decrease of Th2 and Treg cells which was maintained up to T3 of R-CHOP treatment. Two cycles of treatment have already induced significant growth in the Th1/Th2 ratio and maintained a progressive increase since then. We found a signifi-cant correlation between the level of Th1/Th2 ratio at baseline and T3, and the realization of the complete response (CR). There was a correlation between the percentage of Th1 cells and the reali-zation of the CR, with the cut-off value of 43.09 of Th1 cells. Conclusion: We believe that in newly di-agnosed patients, R-CHOP may change the transformation of Th1/Th2 ratio by inhibiting the ampli-fication of Th2. This analysis showed that the higher Th1/Th2 ratio and the increase of Th1 cells significantly correlated with the CR achievement, which suggests a strong transformation of T-cell polarization from a pro- to an anti-tumor T-cell response during treatment.

1. 引言

DLBCL是非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin’s lymphoma, NHL)最常见的亚型，约占NHL的三分之一 [1] 。根据国际预后指数(International prognostic index, IPI)评分、病理类型和诊断时的表现状态(Performance status, PS)对其评估，R-CHOP方案可显著提高60%~80%患者的生存率，与6个周期的CHOP治疗相比，6个周期的R-CHOP方案显著改善了总生存率(Overall survival, OS) (3年OS：78.1% vs. 67.7%) [2] [3] 。大部分的DLBCL患者可在标准的R-CHOP方案后治愈，尽管治疗方案的多样性可能会降低患者的难治性和死亡率，但约30%的患者会朝着复发/难治性疾病发展 [4] 。由于生物多样性和异质性，用于评估淋巴瘤患者预后的IPI评分可能无法准确预测单个患者的预后 [5] 。因此，探索更准确的R-CHOP治疗患者的预后指标并制定个体化治疗策略以改善患者的预后和OS非常重要。淋巴细胞在NHL的免疫监测中发挥着重要作用。淋巴减少症是包括DLBCL在内的各种NHL亚型的不良预后因素，这一观察支持了这一观点 [6] 。肿瘤浸润T细胞的类型和计数与DLBCL患者的预后和无复发生存率相关 [7] 。浸润性CD8⁺T细胞水平升高与更好的临床结果相关 [8] 。Treg在淋巴瘤发病机制和进展中的重要性仍存在争议 [9] 。DLBCL中CD4⁺T细胞的显著减少与NHL的各种不良预后因素相关。在接受R-CHOP治疗的DLBCL患者中，诊断时CD4⁺T细胞较低与预后不良显著相关 [10] 。与细胞免疫相关的干扰素γ由Th1淋巴细胞分泌，而Th2淋巴细胞分泌高水平的白介素-4和白介素-13，并在体液免疫和抗体产生中占据关键地位 [11] 。Palma等人观察到，与对照组相比，非进展性慢性淋巴细胞白血病患者表达大量Th2细胞 [12] 。尽管我们认为Th2细胞有利于肿瘤发生 [13] ，但这些CD4⁺T细胞亚群的作用仍有争议。在各种肿瘤类型的研究结果中发现，Th2亚群在诱导抗肿瘤免疫中的矛盾作用 [14] 。NHL患者Th1和Th2细胞亚群的百分比以及与T细胞亚群相关的细胞因子水平尚未得到充分研究，包括肿瘤免疫中Th1和Th2细胞的极化。已经表明，常规CD4⁺T细胞亚群在分型和功能平衡方面发生变化，在R-CHOP治疗的临床缓解后，这些失衡很难显著逆转 [15] [16] 。国内外研究中R-CHOP治疗对T细胞亚群影响的差异表明了收集临床数据和进行相关分析的重要性。我们观察了R-CHOP治疗后淋巴细胞亚群的动态变化。此外，我们的目的是使用流式细胞术评估DLBCL患者在各治疗阶段的Th1、Th2淋巴细胞的极化及其与临床指标、疾病结局的相关性。为了识别新的预后标志物并实施有效的个性化免疫治疗，进一步破译R-CHOP治疗前后DLBCL患者的免疫应答是绝对必要的。

2. 资料和方法

2.1. 一般资料

这是一项回顾性研究，由重庆医科大学附属第一医院伦理委员会批准。在2019年1月至2022年1月期间，我们整理了31名新确诊DLBCL患者的临床数据，其中包括13名女性和18名男性。纳入标准：1)根据2016年修订的世界卫生组织淋巴肿瘤分类，组织病理学和免疫组织化学检查新诊断为DLBCL；2) 年龄 ≥ 18岁的患者；3) 在本研究之前未开始任何治疗；4) 用6~8个周期的R-CHOP处理，周期为21天。排除标准包括严重的心脏、肝脏或肾脏功能障碍；合并免疫或内分泌系统疾病；既往有其他器官恶性肿瘤病史。本研究获得了所有参与患者的书面知情同意书。

2.2. 样本采集

在以下四个时间点，在乙二胺四乙酸(EDTA)处理的试管中采集外周血以检测淋巴细胞亚群：T0，R-CHOP开始前；T1，在接受两个周期的治疗后；T2，四个治疗周期后；T3，六个周期治疗结束。

2.3. 流式细胞术

根据制造商的说明，使用TruCOUNT管和BD Multitest 6色TBNK试剂盒(BD Biosciences)测定循环淋巴细胞亚群、NK细胞的百分比和绝对计数。简而言之，50 μL全血在室温下用6色TBNK Ab鸡尾酒在黑暗中标记15分钟。加入450 μL FACS裂解溶液后，用FACSCanto流式细胞仪处理样品。对于CD4⁺T辅助细胞亚群的胞浆内检测，首先在Golgi Stop存在下，用50 ng/mL佛波醇肉豆蔻酸盐(Phorbol myristate acetate, PMA)在经典培养基中加离子霉素(1 µg/mL)培养新鲜分离的PBMC 5小时。T细胞活化后用PBS洗涤两次，按照制造商的说明使用人Th1/Th2/Th17/Treg表型试剂盒渗透并染色。最后使用FACSDiva软件(BD)分析通过流式细胞术洗涤和收集的细胞。Th1、Th2、Th17和Treg细胞的结果以CD4⁺T细胞群的百分比来描述。

2.4. 统计分析

结果以平均值 ± 标准差(SD)、中位数和四分位间距(IR)表示。通过方差分析(ANOVA)评估各组之间标记物的差异。通过Spearman秩相关检验确定两个连续变量之间的相关性。两个独立组的值可通过非配对双尾t检验或Mann-Whitney U检验进行比较。如果数据未能满足方差同质性假设，我们应用韦尔奇检验。使用GraphPad Prism第6版进行统计分析。所有结果的统计学差异由p < 0.05确定。

3. 结果

3.1. 患者临床特征

本研究的31名患者，诊断中位年龄63岁，随访时间为6~38个月。使用IPI评分系统，10名(32.2%)患者被分类为低风险(评分0~1)，8名(25.8%)患者被分为中风险(评分2)，9名(29.0%)患者被划分为高风险(评分3)，4名(13.0%)患者被归类为高风险(评分4~5)。其中，共有6名患者被归类为PS ≥ 2，25名患者被归类为PS < 2。总有效率为87.1% (27/31)，其中12名患者达到CR。纳入患者的临床特征如表1所示。

Table 1. General clinical information of patients

表1. 患者一般临床资料

3.2. R-CHOP治疗DLBCL患者外周血淋巴细胞亚群的动态变化

我们发现，淋巴细胞百分比在2个周期的治疗后显著下降，此后一直保持(T0 vs T1, p = 0.017; T0 vs T3, p = 0.001)，直到6个周期的R-CHOP治疗后达到最低(图1(A))。淋巴细胞绝对数与百分比有相似的下降趋势，但仅显示T3和T0之间的统计学显著性(图1(A))。我们观察到，与未治疗期相比，CD4⁺T细胞的百分比总体呈上升趋势(T0 vs T2, p = 0.013; T0 vs T3, p = 0.015) (图1(B))。与未治疗时相比，CD4⁺和CD8⁺T细胞的总计数逐渐减少(CD4: T0 vs T1, p = 0.012; T0 vs T2, p = 0.003; CD8: T0 vs T2, p = 0.007)。计数显示出恢复的趋势，但与T0时相比，T3时也显著降低(CD4: T0 vs T3, p = 0.014; CD8: T0 vs T3, p = 0.014) (图1(B)~(C))。T1时NK细胞百分比明显较T0时更高，后续仍保持较高水平(T0 vs T1, p = 0.004; T0 vs T3, p = 0.016) (图1(D))。此外，我们发现Th1、Th17细胞百分比在治疗后显著升高，相反Th2、Treg细胞百分比在治疗后逐渐降低。特别是，Th1细胞从T0时的22.49%开始增加(IR 14.32%~28.14%)，直到T3时其增长达到显著差异(IR 25.85%~42.99%) (p = 0.017) (图2(A))。Th2细胞从T2开始显著减少，并在T3时保持稳定(T0 vs T2, p = 0.029; T0 vs T3, p = 0.022) (图2(B))。尽管Th17细胞百分比仅在4个治疗周期后显著增加(p = 0.016) (图2(C))，但Treg细胞仅在T3时显著减少(p = 0.035) (图2(D))。通过计算治疗期间Th1细胞与Th2细胞的比率，可以更明确地表达Th1和Th2的转化，这使我们能够通过单个值监测化疗期间T细胞亚群的调节。最早时间点的中值Th1/Th2比值为0.51 (范围0.32~0.91)。我们可以观察到R-CHOP治疗2个周期后Th1/Th2比值显著增加，并在随后的时间点保持稳定增长(T0 vs T1, p = 0.002; T0 vs T2, T0 vs T3, p < 0.0001) (图3)。

Figure 1. Dynamic changes of Lymphocyte, CD4⁺T, CD8⁺T cells and NK cells (all p values were the results of comparison with T0, *p < 0.05, **p < 0.01)

图1. 淋巴细胞、CD4⁺T、CD8⁺T细胞和NK细胞的动态变化(所有P值均为与T0时期比较，*p < 0.05，**p < 0.01)

Figure 2. Changes of T-cell cytokine in paired peripheral blood samples before and after R-CHOP treatment

图2. 配对外周血样本在R-CHOP治疗前后T细胞因子的变化

我们分析了T0和T3时Th1或Th2细胞频率对Th1/Th2比率的调节，以确定Th1/Th1比率的降低与Th1和Th2细胞的变化之间的关系(表2)。发现两个时间点Th1/Th2比值的增加与Th1和Th2细胞的变化之间存在显著相关性，这与先前研究中Th1/Th1失衡与DLBCL的作用相对应 [16] [17] 。

Figure 3. Longitudinal analysis of the Th1/Th2 ratio from paired peripheral blood samples before and after R-CHOP treatment (**p < 0.01, ****p < 0.0001)

图3. R-CHOP治疗前后配对外周血样本的Th1/Th2比值纵向分析(**p < 0.01, ****p < 0.0001)

Table 2. Correlation analysis between the Th1/Th2 ratio and Th1 or Th2 cells at T0 (A) and T3 (B)

表2. T0 (A)与T3 (B)时Th1/Th2比值与Th1或Th2细胞的相关性分析

3.3. CD4⁺T细胞的细胞因子产生、DLBCL生物学和治疗反应的调节

为了研究Th1和Th2的调节与R-CHOP治疗后临床结果之间的关系，我们根据6个治疗周期后的临床结果标记了T0和T3时间点的Th1/Th2比值。既往未治疗和T3期Th1/Th2比值较高与CR的实现呈正相关(T0: p = 0.009; T3: p = 0.003) (表3)。因此，我们根据患者的临床特征，包括PS、IPI评分和疾病结局，研究了DLBCL的Th1、Th2细胞频率和Th1/Th2比率。我们假设高IPI评分组的Th2细胞百分比高于低IPI评分组(中位数41.66% vs 32.20%；p = 0.044) (图4(A))。此外，我们的结果显示，PS < 2的DLBCL患者的Th1细胞比例显著高于PS患者 ≥ 2 (中位数27.54% vs 20.33%；p = 0.045) (图4(B))。此外，与未处于缓解期的患者相比，CR患者的Th1细胞百分比显著升高(中位数35.85% vs 23.82%；p = 0.029) (图4(C))。

在31名患者进行了6个R-CHOP周期(T3期)后，使用ROC曲线和相应AUC进行的分析表明，Th1细胞的增加与CR的实现之间存在相关性，Th1的临界值为43.09% (p = 0.017) (图5)。根据这一临界值，31名患者中有7名(22.6%)被视为Th1升高组(Th1 > 43.09%)，24名(77.4%)被认为是Th1下降组(Th1 < 43.08%)。在高Th1组中，所有患者均获得CR。在T3期，Th1细胞百分比超过43.09%与Th2细胞减少之间存在显著相关性(p = 0.001) (表4)。Th1和Th2细胞的百分比、Th1/Th2的比率与感染的发生率、部位和类型之间没有显著的相关性，因为聚乙二醇化G-CSF (Granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)具有普遍的长效作用，在31名患者的队列中观察到较少的感染事件和较早的发生率。

Table 3. Modulation of Th1/Th2 ratio and clinical response to R-CHOP

表3. Th1/Th2比值的调节与R-CHOP治疗的临床结果

Figure 4. Comparison of CD4⁺T cell subsets according to the IPI score, PS and disease outcome grouping in DLBCL patients

图4. DLBCL患者根据IPI评分、PS和疾病转归分组的CD4⁺T细胞亚群比较

Table 4. Th2 cells response to R-CHOP according to the 43.09 cut-off of Th1 cells at T3

表4. 根据T3处Th1细胞的43.09截止值，Th2细胞对R-CHOP的反应

Figure 5. Th1 and response to treatment. ROC curve analysis for the optimal cut-off point of the Th1 at T3 of R-CHOP treatment

图5. Th1和对治疗的反应。R-CHOP处理T3处Th1最佳临界点的ROC曲线分析

4. 讨论

R-CHOP是目前DLBCL患者的标准治疗方案，有助于提高患者的生存率。利妥昔单抗的抗肿瘤作用由多种机制介导，NK和T细胞介导免疫系统的激活，通过启动CD4⁺T细胞的分化而增强。淋巴瘤患者的免疫反应状态和治疗后免疫系统动力学的影响是维持基于利妥昔单抗化疗的长期保护和抗肿瘤疗效的关键因素 [15] [18] [19] 。特异性抗肿瘤T细胞克隆常常诱导无效的抗肿瘤免疫应答 [20] ，这可能是由于T细胞无应答、T细胞亚群或T辅助细胞亚型失衡。事实上，化疗不同阶段患者外周血T淋巴细胞亚群的分化扰乱了平衡，免疫反应的抑制和监控系统的失效可能会促进肿瘤免疫逃逸机制的建立。然而，DLBCL患者的T淋巴细胞亚群分布与疾病活动或临床结果之间的关系仍不清楚。在这项研究中，我们发现化疗的细胞毒性效应导致DLBCL患者外周血中淋巴细胞、CD4⁺、CD8⁺T细胞计数降低，NK细胞百分比升高。在整个治疗期间，淋巴细胞亚群的计数仍低于新诊断时，但下降趋势的最早逆转发生在T3。获得CR的患者T细胞的绝对数量和NK细胞的百分比较高，提示淋巴细胞亚群的绝对数量和百分比可以作为预测治疗反应的潜在指标，但其在评估R-CHOP方案预后中的作用尚未得到充分研究。

在个体内变异分析中，我们检测了Th1、Th2、Th17和Treg细胞因子亚群的百分比，发现R-CHOP显著影响T细胞的分布。在R-CHOP治疗2个周期后，体内Th1/Th2比率显著升高，这与Th1和Th2细胞显著相关，尽管我们的结果中的主导作用尚不清楚，主要是通过抑制Th2活化和促进Th1亚型分化。我们注意到，通过分析Th1和Th2细胞的调节与临床结果之间的关系，T3时Th1细胞的百分比超过43.09%与CR的实现之间存在相关性。令人惊讶的是，我们的结果显示，CR患者和PS < 2患者的Th1细胞频率明显高于其他患者。根据这一结果，观察到高IPI评分组患者的Th2细胞百分比显著高于其他组。

其他研究中介绍了R-CHOP治疗后DLBCL患者Th1和Th2细胞亚群的动态变化，提出了一些相反的观点。在不同癌症类型的研究中，已经注意到Th2亚型在诱导抗肿瘤免疫中的矛盾作用 [14] 。尽管Th2细胞似乎与肿瘤侵袭性相关，但通过诱导B细胞活化或产生细胞因子IL-10来抑制免疫，一些研究支持Th2及其标志性细胞因子IL-4的抑瘤特性参与肿瘤抑制，包括恶性淋巴瘤、骨髓瘤、乳腺癌和黑色素瘤 [21] [22] [23] [24] [25] 。关于NHL患者Th2细胞的临床意义的研究非常有限。Deghani等人 [22] 评估了48名DLBCL患者的外周血样本，他们发现缓解患者的Th2细胞百分比显著高于新诊断患者。Jones等人 [26] 揭示了Th2细胞分泌的IL4的高表达与抑制肿瘤细胞增殖和提高生存率显著相关。Kurtz等人 [27] 证明皮下注射IL-4对惰性和侵袭性NHL具有抗肿瘤活性，尽管内源性IL-4水平似乎与NHL的预后无关。Mori等人 [16] 显示，在19名未经治疗和18名处于CR期的DLBCL患者中，Th1和Th1/Th2比例在达到CR的患者中更高。他们认为Th1/Th2失衡可能在促进淋巴瘤进展中发挥关键作用，Th1优势状态可能有助于持久缓解。

尽管与我们的研究数据存在一些差异，但他们的研究与我们的结果一致。Yin等人 [28] 研究了治疗前后DLBCL患者T淋巴细胞亚群的动态变化以及相关调节基因的表达模式。他们表明，与基线水平相比，调节Th1和Th2细胞分化所需的转录因子在3个周期后显著增加。Deligne等人 [29] 分析了抗CD20治疗诱导抗肿瘤T细胞反应的机制，包括通过过继T细胞转移试验将活化的CD4⁺T细胞亚群分化为Th1表型。Puzzolo等人 [30] 予以伊布替尼治疗70例新诊断的慢性淋巴细胞白血病患者中发现，抑制Th2细胞的过度活化可能有助于宿主免疫监测，并诱导Th2/Th1比值降低，这与CR的实现有显著相关性。

因此，我们的研究可以为以下事实提供证据：DLBCL患者的Th1淋巴细胞与抗肿瘤免疫应答正相关，因此，Th1比例越高，这些患者的表现状态越好，预后良好，病情持续缓解。

如今，以往研究中Th17和Treg细胞的动态变化和免疫效应令人困惑。我们的结果表明，在R-CHOP处理2个周期后，Treg细胞的频率显著降低。与我们的结果一致，Chang等人 [31] 发现Treg细胞下降，并支持Treg可能损害抗肿瘤免疫，并与不良预后相关。尽管Treg细胞已被证实与某些类型淋巴瘤的良好预后相关，但它们与非GCB型DLBCL不一致 [32] 。Dehghani等人 [33] 报道，淋巴瘤患者中Treg绝对计数和Treg/Th17比值的高水平与良好的预后相关，但Th17淋巴细胞水平在疾病不同阶段的患者之间变化不显著，很可能是由于持续时间有限、未能平等地随访所有患者，这需要进一步研究。

目前的研究有一些需要考虑的局限性。首先，分析了相对较少的患者，因此需要在更大的队列研究中确认新的预后标志物。其次，没有记录T淋巴细胞亚群失衡与感染的发生、部位和类型之间的关系。第三，我们的研究缺乏Th1和Th2细胞相关细胞因子的数据分析。未来需进一步描述Th1和Th2细胞相关细胞因子，以阐明这些亚群在淋巴瘤患者疾病结局中的作用。淋巴细胞计数和表型也应包括在预测DLBCL患者未来OS和PFS中。

5. 总结

一些研究认为，外周血Th2细胞频率的增加可能是预测NHL患者化疗反应和临床结局的良好预后因素。我们假设，在新诊断的患者中，R-CHOP可以通过限制Th2细胞的浸润来增强人体免疫反应并恢复有效的免疫监测，这可能会诱导宿主抗肿瘤免疫激活并影响患者的预后。我们的结果表明，治疗期间Th1细胞的增加和Th2细胞的减少之间存在显著的相关性，并且由于治疗期间T细胞极化从促肿瘤向抗肿瘤T细胞反应的强烈转变，因此与良好的预后相关。需要更大的病例系列甚至对照研究来确定R-CHOP治疗是否能够通过调节宿主免疫来抵抗感染风险并加强疾病控制。然而，仍需要更多的研究来评估R-CHOP治疗期间Th1和Th2细胞相关的细胞因子，以阐明T辅助细胞亚群的临床意义。