1. 引言
李比利氏灰粉蚧Dysmicoccus lepelleyi (Betrem)是海关检疫经常截获的一种有害生物，英文名Le Pelley Mealybug。此有害生物寄主广，已知有15个科30余种，包括山竹、红毛丹、椰子、香蕉等热带水果，主要分布于印度尼西亚、柬埔寨、马来西亚、菲律宾、新加坡、泰国、越南等与我国有水果贸易往来的东南亚国家，但该虫在我国尚无分布。
本文通过对来自印度尼西亚进行分子生物学和形态学鉴定，并对我国截获的李比利氏灰粉蚧进行分析，确定了口岸鉴定该虫的分子生物学鉴定方法较适合常规鉴定，并就该虫的截获特点进行了分析，明确了货检、山竹寄主、来源国为泰国是截获该虫的重要途径。
2. 分子鉴定
2.1. 供试虫源
印度尼西亚山竹上的粉蚧雌成虫2头。
2.2. 提取DNA及扩增方法
取2头雌成虫(样品编号为2-F-ZLJ_B05和3-F-ZLJ_C05)用于DNA提取，提取方法参考廖力等 [1] 的研究。扩增CO Ⅰ片段引物序列分别为PcoF1和LepR1，PCR扩增条件参考Park等 [2] 的研究。PCR反应中的引物来自安升达生物科技有限公司，试剂来自天根生化科技(北京)有限公司，扩增产物经电泳检测有目标扩增片段后送安升达生物科技有限公司进行正反向测序。测序结果采用MEGA 7软件进行校对和拼接 [3] ，除去两端引物序列，获得长度分别为658 bp和659 bp的DNA条形码序列。
2.3. 分子序列的比对
将收到的2条序列2-F-ZLJ_B05和3-F-ZLJ_C05分别在NCB I中进行BLAST比对，2-F-ZLJ_B05与Dysmicoccus lepelleyi的CO Ⅰ基因序列KY372997相似度为99.68%；3-F-ZLJ_C05与Dysmicoccus lepelleyi的CO Ⅰ基因序列KX015111相似度为99.84%。结果显示2-F-ZLJ_B05和3-F-ZLJ_C05都是李比利氏灰粉蚧Dysmicoccus lepelleyi的CO Ⅰ基因序列。
2.4. 系统发育树的构建
从GenBank下载6条已公布的灰粉蚧属Dysmicoccus线粒体CO Ⅰ基因序列和大洋臀纹粉蚧Planococcus minor CO Ⅰ基因序列，结合已有2条CO Ⅰ基因序列(2-F-ZLJ_B05和3-F-ZLJ_C05)，利用MEGA X软件比对并剪切得到615 bp核心序列集(表1)。
Table 1. CO Ⅰ gene sequence information for phylogenetic tree
表1. 用于构建系统发育树的物种CO Ⅰ基因序列信息
Figure 1. Phylogenetic tree based on neighbor-joining method (NJ)
图1. 基于邻接法(NJ)构建的系统发育树
基于9条Dysmicoccus属CO Ⅰ基因序列，以Planococcus minor CO Ⅰ基因序列为外群。采用最大似然法(Maximum likelihood method, ML)以及邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建系统发育树。ML树使用IQ-TREE web server (http://iqtree.cibiv.univie.ac.at/)的默认参数进行运算。NJ树利用MEGA X软件进行运算，进化距离的计算采用Kimura 2参数模型(Kimura 2-parameter model)，Bootstrap值为1000。ML树和NJ树相对位置基本一致，Dysmicoccus lepelleyi分为2支，其中Dysmicoccus lepelleyi_2-F-ZLJ_B05与Dysmicoccus lepelleyi_KY372997聚为1支(图1~2)。
Figure 2. Phylogenetic tree based on maximum likelihood method (ML)
图2. 基于最大自然法(ML)构建的系统发育树
3. 形态特征
挑出山竹上的粉蚧雌成虫(图3)，制作成玻片标本(图4)，体背侧缘有一列大的领状管是该种鉴定的关键特征(图5)，具体鉴定步骤可参照SN/T 4995-2017《李比利氏灰粉蚧检疫鉴定方法》 [4] 、焦懿等 [5] 和Williams [6] 的研究。
Figure 3. Habitus of Dysmicoccus lepelleyi in mangosteen
图3. 李比利氏灰粉蚧在山竹上的生态照
Figure 4. Slide of Dysmicoccus lepelleyi in this study (ventral view)
图4. 本研究截获的李比利氏灰粉蚧玻片图(腹面)
Figure 5. Tubular duct as an important identification characteristic of Dysmicoccus lepelleyi
图5. 李比利氏灰粉蚧的重要鉴定特征管状腺
4. 截获情况
截至2023年3月底，我国口岸共截获过4155批次的李比利氏灰粉蚧，其中，2870批次为货物检出截获，占比69.1%，我国的李比利氏灰粉蚧由贸易水果检出的比重较大；旅客携带物中检出1279批次，占比30.8%；其余还有少量通过运输工具、包装铺垫物等检出。货检是截获该虫的重点，旅检次之，因此应加强对货物和旅客携带物两方面的查验，提高该虫的检出率。
从截获的来源地区来看，包括泰国、印度尼西亚、马来西亚等20个国家或地区，多为与我国有贸易往来的东南亚国家，也包括机场吞吐量较大的国际中转站(如美国、中国香港等)。其中，截获较多的包括泰国2064批次，马来西亚585批次，印度尼西亚378批次，越南240批次，中国澳门176批次。泰国是截获该虫的重要来源国，其他东南亚国家也较易截获。因此，应加强对东南亚主要贸易水果国的货检查验，以提高对该虫的检出率，同时针对一些航班中转站的旅客携带物也应重点防范。
从截获的寄主水果来看，李比利氏灰粉蚧的寄主包括山竹、番荔枝、红毛丹、蛇皮果、火龙果、榴莲、菠萝蜜等10余种水果，其中多为热带水果。截获物中山竹3891批次，占比93.6%，为截获最多的寄主水果，所以山竹为截获该虫的重点。
5. 讨论
由于李比利氏灰粉蚧的玻片标本制作难度较高，一般没有粉蚧制作鉴定经验的人员鉴定起来难度较大；且不同寄主、不同来源地区的标本在形态特征上略有差异，如不同标本的背毛长度、腹部管腺的多少、后足是否有透明孔会有差异，从而进一步增加了鉴定难度。本文推荐了一种分子生物学鉴定方法，可以降低鉴定门槛，没有粉蚧鉴定经验或没有昆虫分类知识背景的人员也可以进行鉴定。但鉴定粉蚧类昆虫，制作玻片标本为基本技能；分子鉴定可作为辅助手段在快速鉴定及残缺样品、对非成虫虫态鉴定时进行判断。一旦检出此虫，进出口果蔬、苗木等相关处理方法可参照SN/T 5543-2022《李比利氏灰粉蚧检疫辐照处理最低吸收剂量》 [7] 。本文对海关检疫系统截获的李比利氏灰粉蚧进行了汇总分析，通过掌握该虫的截获规律，做好相应的重点工作，严防该虫入侵我国，保护我国的农业生态健康。
基金项目
国家重点研发计划(2021YFF0703804)；海关总署科技项目(2018IK002)。
NOTES
*第一作者。
#通信作者。