中性粒细胞胞外诱捕网在呼吸系统炎性疾病中的作用

Role of Neutrophil Extracellular Trap Net in Respiratory Inflammatory Diseases

摘要: 中性粒细胞被称为先天免疫系统的第一反应细胞，参与感染或者损伤期间的初始早期宿主防御反应。中性粒细胞能够释放“中性粒细胞胞外陷阱”(neutrophil extracellular traps, NETs)参与防御反应，NETs是一种由脱氧核糖核酸(deoxyriboNucleic Acid, DNA)修饰的组蛋白和细胞毒性肽/蛋白质组成的胞外无膜纤维网状结构，其形成途径可分为氮氧化物(nitrogen Oxide, NOX)依赖性NETs形成及氮氧化物非依赖性NETs形成两大类。NETs是把“双刃剑”，除具有抗菌作用外，但过量聚集也会给细胞或组织造成损伤并影响呼吸系统疾病的最终转归。NETs参与慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺囊性纤维化、急性肺损伤等多种以气道炎症为主要特征的呼吸系统疾病过程。抑制NETs表达有助于缓解呼吸系统炎性疾病，为临床防治提供新的靶点和方法。

Abstract: Neutrophils are called the first reaction cells of innate immune system, and participate in the initial early host defense response during infection or injury. Neutrophils can release “neutrophil extra-cellular traps” (NETs) to participate in defense reaction. NETs are an extracellular membraneless fibrous network composed of deoxyriboNucleic Acid (DNA)-modified histone and cytotoxic pep-tide/protein. Its formation pathways can be divided into two categories: nitrogen Oxide (NOX)-dependent NETs formation and nitrogen oxide-independent NETs formation. NETs are a “double-edged sword”, which has antibacterial effect, but excessive aggregation will also cause damage to cells or tissues and affect the final outcome of respiratory diseases. NETs are involved in many respiratory diseases, such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma, pulmonary cystic fibrosis and acute lung injury, which are characterized by airway inflammation. Inhibiting the expression of NETs is helpful in alleviating respiratory inflammatory diseases and provides new targets and methods for clinical prevention and treatment.

1. 引言

中性粒细胞被称为先天免疫系统的第一反应细胞，参与感染或损伤的早期防御反应，在宿主感染和炎症反应期间充当第一道防线 [1] 。中性粒细胞被激活后能发挥对抗炎症损伤，维持细胞稳态，保持免疫平衡的作用 [2] ；其功能包括吞噬、脱颗粒、产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)和活性氮以及产生促炎细胞因子等，此外中性粒细胞还能够释放一种“中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps, NETs)”的物质参与免疫反应 [3] 。1996年，Takei [4] 等用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸盐(phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA)刺激中性粒细胞时，细胞会因染色质去浓缩、核膜溶解和释放包裹有颗粒蛋白的染色质而死亡，是区别于细胞凋亡和坏死的细胞死亡方式。在2004年时，Brinkman等 [5] 利用不同的激动剂(例如脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)或白介素-8)刺激分离出的中性粒细胞，进一步证实并命名了NETs这种独特的生物学网状结构，同时发现它还具有遏制细菌繁殖的能力。研究表明除抗菌作用外，NETs的过表达也会对组织造成感染和损伤，从而影响呼吸系统的正常生理功能，导致多种呼吸系统炎性疾病的发生 [6] 。大量的中性粒细胞所产生的NETs在气道和肺组织的聚集是许多呼吸系统疾病发生的重要标志 [7] 。因此，充分认识NETs的结构组成和形成过程有助于更深层次地了解其对呼吸系统的作用机制，也能够为相关呼吸道炎性疾病的治疗提供新的思路。本文就中性粒细胞胞外诱捕网与呼吸系统炎性疾病的关系及作用机制进行综述。

2. NETs的组成以及形成机制

2.1. NETs的结构以及组成

NETs是一种由脱氧核糖核酸(deoxyribo nucleic acid, DNA)修饰的组蛋白和细胞毒性肽/蛋白质组成的胞外无膜纤维网状结构，主要成分是DNA，也包含部分在NETs形成期间具有重要作用的颗粒蛋白，如髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、弹性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)、防御素及抗菌肽等，除去初级颗粒蛋白外，还包括二级/三级颗粒蛋白质(如乳铁蛋白、明胶酶等) [8] 。由NETs主导的中性粒细胞变化和死亡的形成过程被称为NETosis，属于细胞程序性死亡方式 [9] 。NETosis发生时，中性粒细胞经由不同激动剂刺激后开始活化，细胞核的形状发生改变，核分叶现象消失，紧接着染色质去致密化，核膜分层，胞质内的颗粒逐渐解体，同时解体颗粒蛋白与核酸物质在核膜分裂时形成的囊泡相互融合成为混合物，伴随中性粒细胞的细胞膜破裂，核酸和颗粒蛋白混合物释放到胞外形成以核酸为骨架并附着大量颗粒蛋白的网状结构 [10] [11] 。NETs对机体免疫反应来说是一把“双刃剑”，它具有捕获病原体以及降解细胞因子或趋化因子的保护作用，同时当NETs被低效消除/过度募集时也对宿主免疫系统造成严重损害 [12] [13] 。

2.2. NETs的形成机制

NETs的形成途径被分为两大类，其中包括氮氧化物(nitrogen oxide, NOX)依赖性NETs形成及氮氧化物非依赖性NETs形成 [14] 。针对于NOX依赖性这类经典的NET形成途径主要通过两种不同化学物质参与的激动机制(主要包括PMA和LPS)诱导形成。在PMA的刺激下，二酰基甘油模拟物、内质网钙源进入中性粒细胞细胞质并增加了蛋白激酶C的活性，从而通过NAPDH氧化酶2抗体(gp91phox/NOX2)启动磷酸化的过程，该过程促进 NOX酶的组装推动了ROS的产生，随后ROS分解核膜以及颗粒蛋白，分解后的颗粒蛋白能够自由地与细胞核相互作用，切割组蛋白并促进染色质去浓缩，最终导致中性粒细胞和去浓缩后DNA的膜完整性丧失，此时被颗粒状蛋白内容物装饰成为网状结构的大分子复合物随后被释放到细胞外环境中以发挥抗微生物功能 [15] 。而PMA作为常见的一种非生理性的NOX依赖性激动剂，它所引起的NETs产生机制在疾病中的实用意义是有限的。相对而言LPS诱导的NOX依赖性NETs形成则通过由c-Jun N-末端激酶(JNK)介导的单独途径发挥作用，关键部分类似于NOX2磷酸化后的PMA，但在此步骤的上游信号中与PMA激动机制存在重要差异。LPS与中性粒细胞表面上的TOLL样受体4 (recombinant Toll like receptor 4, TLR4)结合诱导NOX依赖性NETs形成 [16] 。Khan MA [17] 等通过使用TAK242以及JNK抑制剂，可消除或干扰LPS诱导的NETs的形成，这从侧面说明PMA与LPS的确是通过不同的机制诱导NETs的产生。

另外一种途径为不依赖NOX诱导NETs的形成的类型，也被称为非典型途径 [18] 。通过非生理性的激动剂的刺激，钙离子载体与存在于细胞质当中的肽酰基精氨酸脱亚氨酶4 (peptidylarginine deiminase 4, PAD4)结合并转移到细胞核中，PAD4将携带正电荷的组蛋白精氨酸残基脱亚胺化为中性瓜氨酸，这过程中瓜氨酸组蛋白3 (citrullinated histone 3, CitH3)的高瓜氨酸化被认为是NOX非依赖性NETs形成所必需的染色质解凝的关键 [12] 。该类型的NETosis发生十分快捷，它与经典途径有所区别的是省略了质膜破裂和细胞裂解的步骤，且参与了将富含DNA的囊泡从细胞核转运到细胞质的过程，最终通过胞外作用进入细胞外空间 [19] 。

3. NETs与呼吸系统炎性疾病的关系

3.1. NETs与慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种以不完全可逆的气流受限为特征的进行性呼吸系统疾病，与肺部所发生的异常的炎症反应紧密相关 [20] 。COPD主要的临床特征是反复的炎症感染，持续性的中性粒细胞浸润气道逐渐对肺组织和肺泡壁造成慢性损害。NETs导致的炎症机制可能是引起COPD的发病机制之一 [21] 。

中性粒细胞可能以NETs的形式介导COPD的发生发展，在COPD患者痰液及血浆中可检测到NETs表达，且急性期患者NETs水平较稳定期明显增高，同时NETs表达水平的高低与COPD患者的气流受限严重程度及病情严重程度密切相关 [22] [23] 。COPD患者疾病严重程度与痰液中微生物态失调同样具有相关性，NETs可能是其潜在生物标志物。Dicker AJ [24] 等人通过对COPD患者痰液DNA进行16S rRNA测序发现嗜血杆菌在患者痰液微生物态失调的情况下属于优势菌属，该细菌可能基于氧化应激反应机制诱导中性粒细胞活化并形成NETs。同时发现嗜血杆菌普遍存在于COPD急性加重期患者痰液中，与COPD恶化关系密切 [25] ，该菌诱导NETs形成并导致中性粒细胞吞噬作用受到抑制，细菌无法被及时清除，NETs持续扩大炎症反应造成组织损伤，患者疾病程度加重。香烟烟雾(CS)作为公认的COPD高危致病因素，香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract, CSE)被证实可依赖NADPH氧化酶活性及ROS产生的氧化应激反应诱导人中性粒细胞中NETs的形成 [26] 。CSE诱导形成的NETs能够刺激巨噬细胞和人支气管上皮细胞(HBEs)分泌肿瘤细胞坏死因子(TNF-α)、白介素1β (IL-1β)等细胞因子产生促炎作用；同时HBEs经由CSE刺激后发现TLR4和P38/NF-κB p65表达相对增强，TLR4/MAPKs/NF-κB信号通路被激活导致下游促炎因子大量释放介导炎症反应；当使用NETs抑制剂脱氧核糖核酸酶I (DNase I)雾化治疗时不仅降低了NETs在气道炎症中的表达，同时也降低了TLR4的表达及P38/NF-κB p65磷酸化水平，表明CSE诱导下NETs的异常表达及促炎作用可能与TLR4/MAPKs/NF-κB炎症信号通路相关 [27] 。

3.2. NETs与哮喘

哮喘是常见的慢性呼吸道炎性疾病中的一种，特征是气道对过敏原反应过度、可逆性气流阻塞、气道水肿和黏液分泌增加。与COPD类似的是哮喘的发病机制同样涉及到气道炎症和气道阻塞 [28] 。

在哮喘患者发生的以嗜中性粒细胞为主的气道炎症中，中性粒细胞活化后形成的NETs具有抵抗细菌感染的能力，但当NETs表达增强导致免疫平衡被打破时，肺泡巨噬细胞降解和去除NETs的能力受损，NETs不能够被及时清除，蓄积体内造成细胞和组织损伤 [29] 。NETs具有相当程度的细胞毒性作用，可直接损坏人肺泡上皮细胞和内皮细胞 [30] ，当表达超过正常时则诱导气道上皮细胞的损伤并且加重炎症反应 [31] 。嗜中性粒细胞引发的气道炎症的哮喘患者的痰液细胞外DNA (eDNA)水平与痰中性粒细胞百分比显著相关，和NETs也密切相关，痰液当中可以检测到NETs可溶性成分且表达增加 [32] 。同时NETs能够介导2型免疫应答反应导致过敏性哮喘的发生 [33] 。此外，Varricchi等人 [34] 发现在哮喘患者外周血血浆中存在NETs的两种重要组分(dsDNA和CitH3)且表达水平增加，并且NETs表达水平也与哮喘患者的肺功能参数呈负相关；据实验结果推测针对NETs衍生产物的测量或许能够代替评估哮喘严重程度的血浆生物标志物的测量，这表明NETs可能从哮喘疾病的病理生理学层面发挥积极作用，对提高呼吸系统炎性疾病诊疗水平有所帮助。

3.3. NETs与肺囊性纤维化

囊性纤维化(cystic Fibrosis, CF)是一种由CF跨膜电导调节因子(cystic Fibrosis Transport Regulator, CFTR)基因突变引起的常染色体隐性遗传性疾病 [35] 。呼吸道上皮CFTR突变结果会导致支气管周围中性粒细胞浸润的表现，呼吸道炎症加剧则造成气道黏液堵塞和纤毛清除受损进而引发CF，主要特征包括与细菌定植相关的反复发作的气道慢性炎症及气道黏液粘度增加导致的肺功能下降，而疾病发展的最终结果是呼吸衰竭 [36] 。

CF中气道炎症和组织损伤的关键炎症细胞是嗜中性粒细胞，中性粒细胞能在细胞表面和吞噬溶酶体膜上表达CFTR [37] 。NETs作为嗜中性粒细胞的活化产物可能是导致CF肺病炎症的关键来源 [38] 。Tucker SL [39] 等人在CF小鼠气道模型中检测到MPO、CitH3的共同定位及接受PAD4介导的NETs释放的嗜中性粒细胞的存在，并且发现囊性纤维化个体和囊性纤维化肺疾病的气道液体中存在大量的NETs。研究表明CF患者气道中NETs特征性游离DNA水平、中性粒细胞炎症和肺功能参数之间存在相关性；肺功能低下的CF患者气道液体中游离DNA水平较轻度肺部疾病患者相比明显升高；同时囊性纤维化气道液体中存在相当数量的CXC趋化因子，而趋化因子CXC配体2 (CXCR2)是囊性纤维化气道微环境中趋化因子的主要结合位点，NETs存在于囊性纤维化气道液体中可能是经由CXCR2介导产生的 [40] 。NETs的形成机制与CF发病机制密切相关，靶向NETs可能对CF疾病诊疗提供新的启发。

3.4. NETs与急性肺损伤

急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是一种由感染性或无菌性损伤引起的肺组织损伤和肺功能障碍急性发作的炎症性疾病，典型特征是肺内皮屏障破坏和血管通透性增加 [41] 。ALI的发病是一个复杂的病理过程，具有高发病率与高死亡率的特点，发展到严重阶段会造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致急性低氧性呼吸功能不全和呼吸窘迫最终发展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distresssyndrome, ARDS)。

NETs对感染性ALI中起到重要影响且与疾病严重程度相关 [42] ，感染性ALI的炎症反应除去细菌感染的作用外同样也有NETs诱导产生的结果。研究发现ALI小鼠模型的肺部细菌感染能够迅速诱导嗜中性粒细胞的募集及肺血管系统和肺泡间隙中NETs的释放；且无论是否使用抗生素配合NETs抑制剂脱氧核糖核酸酶I (deoxyribonuclease I, DNase I)治疗ALI，DNase I都能够通过抑制NETs的产生减少肺损伤从而小鼠的提高生存率 [43] 。另一方面，非感染性因素导致的ALI同样有NETs存在，非感染性ALI中输血相关性ALI (TRALI)是常见的导致输血死亡的主要原因。在实验性TRALI的肺微循环和血浆中发现大量NETs存在并且发现NETs增加了肺微血管内皮细胞的通透性，这是导致TRALI发生的重要条件。血小板促进炎症和损伤的主要机制关键是与中性粒细胞的相互作用，活化的血小板可能经由Raf/MEK/ERK信号通路诱导中性粒细胞产生NETs，当使用特异性MEK抑制剂或使用选择性血栓素受体拮抗剂(主要抑制血小板活化)对中性粒细胞进行预处理后均可发现NETs的形成显著减少，并且靶向抑制NETs后降低TRALI模型小鼠的死亡率，由此推断NETs可能是导致TRALI发病的重要机制 [44] 。除输血能够导致ALI之外，有毒重金属——镉(Cd)的污染也能够过度激活免疫系统产生NETs导致ALI，使用NADPH氧化酶抑制剂(DPI)治疗时能够显著降低Cd诱导的NETs形成，进而降低ALI小鼠模型的死亡率 [45] 。尽管具体作用机制仍不明确，但NETs可能是导致各类ALI疾病发生的关键机制。

4. 靶向抑制NETs治疗呼吸系统炎性疾病的研究前景

通过阻断NETs相关组分或形成途径中的关键蛋白物质能够抑制NETs表达，对治疗呼吸系统炎性疾病来说可能是新的有效手段。NETs可以通过DNase I水解dsDNA的骨架来降解 [46] ，DNase I是能够直接抑制NETs形成的药物。Liu等 [47] 在动物实验中使用DNase I来治疗ALI并观察抑制NETs的效果，发现DNase I处理后的模型NET-DNA量显著减少，CitH3表达明显降低，同时血浆中炎症因子水平也显著降低，NETs形成减少后ALI肺水肿及炎症都有所改善，DNase I确实有望成为治疗ALI的辅助药物。研究发现使用一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)抑制剂可减少哮喘患者中NETs的表达。实验通过添加LPS、PMA及一氧化氮供体(SNP)作为激动剂发现均可刺激中性粒细胞产生一氧化氮(nitrogen monoxide, NO)并诱导NETs产生，使用NOS抑制剂后可阻断NO产生以减轻氧化应激负担从而减少NETs形成，其中NOS抑制剂对PMA和LPS诱导的NETs具有相同的阻断能力。NO可能是通过其活性态氮参与氧化应激导致组蛋白瓜氨酸化作为参与NETs生成的机制之一 [48] ，NOS抑制剂基于阻断NETs形成的能力可能为治疗哮喘提供新的治疗依据。双硫仑是一种被美国食品与药物管理局(FDA)批准用于治疗酒精使用障碍的药物，近来被发现能够阻断巨噬细胞中的Gasdermin D (GSDMD)抑制细胞焦亡；GSDMD对于NETs的形成是至关重要的，它能被切割成N末端片段并在中性粒细胞膜中形成孔隙促进NETs的释放，抑制GSDMD能够导致体内外NETs产生减少并减弱LPS诱导的肺损伤 [49] [50] 。双硫仑在ALI模型中通过剂量依赖性的方式抑制NET形成并改善疾病预后，它能够有效阻断PMA诱导的NET形成并减少肺部NETs表达和血管周围纤维化；在TRALI模型中也能够通过降低NETs水平改善血氧，减少肺水肿，提高动物存活率 [51] 。双硫仑可能通过阻断GSDMD聚合的能力抑制NETs形成从而减轻或缓解炎症反应及肺损伤，成为治疗ALI/ARDS的靶点药物。此外，诸如大环内酯类抗生素(如阿奇霉素)、4型磷酸二酯酶(PDE4)等药物同样对NETs的形成和释放有所影响 [52] [53] ，其具体作用机制仍需更近一步的探索。

5. 总结与展望

中性粒细胞是参与人体先天免疫的重要防线，NETs作为中性粒细胞的产物介导免疫反应并参与呼吸系统炎性疾病中发生发展过程。各种外源性或内源性刺激诱使NETs在呼吸道产生并引发炎症反应，在气道炎症的早期NETs能参与捕获病原体，消灭促炎介质，清除病原微生物感染，减轻炎症反应对呼吸系统疾病的影响。但NETs可能通过驱动趋化因子/介导炎症因子分泌/启动细胞信号通路等多种方式过度表达，加重炎症反应，损伤气道上皮及肺泡内皮细胞导致呼吸系统疾病的发生。NETs涉及各类呼吸系统疾病的生理病理，目前对NETs作用机制的研究还不够清晰，我们需要不断研究如何充分发挥NETs有效作用以及规避有害作用来把握NETs在治病和致病间的平衡。随着越来越多炎性疾病被发现与NETs密切相关，今后对NETs的机制研究以及涉及到机制作用的药物研究将为治疗呼吸系统炎性疾病的治疗提供新方向。

NOTES

^*通讯作者。