核因子κB激活蛋白与疾病关系的研究进展

Research Progress on the Relationship between NF-κB Activating Protein and Disease

摘要: NKAP是一种高度保守的47kD蛋白质，在转录抑制、T细胞发育、成熟和功能获得、造血干细胞的维持和存活以及RNA剪接中发挥重要作用。近年来，对NKAP与疾病发生发展关系的研究越来越多，诸如肺炎、肺癌、乳腺癌、肝细胞癌、结肠癌、肾细胞癌等。多数研究结果表明NKAP作为一个癌基因在肿瘤疾病中发挥作用，其对细胞的增殖、侵袭、迁移有促进作用。但目前对NKAP在疾病中的研究仍较为局限。本文主要就近年来NKAP的研究情况予以综述。

Abstract: NKAP is a highly conserved 47kD protein that plays important roles in transcriptional suppression, T cell development, maturation and functional acquisition, maintenance and survival of hematopoietic stem cells, and RNA splicing. In recent years, more and more studies have been conducted on the relationship between NKAP and the occurrence and development of diseases, such as pneumonia, lung cancer, breast cancer, hepatocellular carcinoma, colon cancer, renal cell carcinoma, etc. Most research results indicate that NKAP plays a role as an oncogene in tumor diseases, promoting cell proliferation, invasion, and migration. However, current research on NKAP in diseases is still relatively limited. This article mainly reviews the research status of NKAP in recent years.

1. 核因子κB激活蛋白(NF-κB Activating Protein, NKAP)

核因子κB (Nuclear factor-κb, NF-κB)是一种具有多向调节功能的转录因子，其调控参与免疫调节、炎症反应和抗凋亡作用等基因的表达 [1] ，还能通过与多种启动子及增强子的相应位点结合而调控细胞增殖、分化、凋亡及恶性转化 [2] 。受体相互作用蛋白(Receptor-interacting protein, RIP)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在肿瘤坏死因子受体-1 (TNF-R1)诱导的NF-κB激活中起重要作用 [3] 。Danying Chen等人 [4] 在酵母双杂交筛选潜在的RIP相互作用蛋白时鉴定了一种新的蛋白并命名为NF-κB激活蛋白(NF-κB Activating protein, NKAP)，是一种高度保守的蛋白质。该研究通过免疫荧光实验证明NKAP是一个核蛋白，它与细胞质蛋白RIP有不同的细胞定位；抑制NKAP表达可抑制TNF-和ILl-诱导的NF-κB激活。因此得出结论，NKAP在TNF-和ILl-诱导的NF-κB激活的一种新的核调节因子，但NKAP作用的确切机制有待进一步研究。随着国内外研究的深入，NKAP在生物体内的多重作用逐渐被揭露。

2. NKAP与疾病的关系

2.1. NKAP与T细胞的关系

T细胞的发育依赖于受体信号转导和转录调控之间的协调相互作用。Anthony G. Pajerowski等人 [5] 研究显示NKAP与组蛋白去乙酰化酶3 (HDAC3)相关，是DNA结合复合物的一部分。此外，NKAP也与Notch辅抑制复合物相关。进一步研究发现在T细胞发育过程中NKAP的表达与Notch靶基因的表达呈负相关，该结果表明NKAP可作为Notch信号的一种转录抑制因子，作用于Notch靶基因，是T细胞发育所必需的。骨髓中的B细胞或胸腺中的T细胞发育完成后，并不会产生参与免疫应答的淋巴细胞，这些新产生的B细胞和T细胞还没有能力，必须经历一个成熟的步骤。Fan-ChiHsu等人 [6] 通过动物实验发现NKAP条件敲除T细胞是功能不成熟的近期胸腺迁出细胞，证明了转录抑制因子NKAP的丢失完全阻断T细胞的成熟，NKAP是T细胞成熟和获得功能能力所必需的。Barsha Dash等人 [7] 的研究结果也证明NKAP和HDAC3的相关性对T细胞成熟至关重要。不变性自然杀伤T细胞(iNKT)细胞是一种具有适应性和固有淋巴细胞特征的独特细胞系。研究显示 [8] ，在iNKT发育中，NKAP可调节iNKT的增殖和分化，NKAP相关蛋白组蛋白去乙酰化酶3的缺失导致了不变性自然杀伤T细胞发育的阻滞，这表明NKAP和HDAC3在功能上相互作用，控制不变自然杀伤T细胞的发育，进一步证明了转录抑制因子NKAP是iNKT发育所必需的。Puspa Thapa等 [9] 研究结果同样表明NKAP调控了不变性自然杀伤T细胞发育和分化的多个步骤。

2.2. NKAP与造血细胞的关系

造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)的稳定状态是平衡分化、增殖和自我更新等过程来维持的，这种平衡的破坏会导致造血功能衰竭。Anthony G. Pajerowski等人 [10] 发现，胚胎发育期间在造血干细胞和所有造血细胞系中敲除转录抑制因子NKAP的条件敲除小鼠表现出围产期致命性和造血功能的丧失。成年小鼠因NKAP的诱导缺失而在2周内死亡，此时骨髓造血功能停止，造血干细胞消失，并且这种造血功能衰竭和致死率是细胞固有的。该研究的结果表明，NKAP是成人造血干细胞维持和生存所必需的极少数转录调节因子之一。NKAP可与HDAC3结合，且都对HSC的维持和生存至关重要。Shapiro MJ教授等人 [11] 对NKAP进行了一系列截断和丙氨酸扫描，以确定HDAC3的最小结合位点。Y352或F347对丙氨酸的突变均消除了NKAP与HDAC3的关联，但没有改变NKAP的定位或表达。随后，在体内使用关联条件删除/再表达系统，结果显示NKAP中的Y352对其与HDAC3关联以及HSC的维持和存活至关重要，但对小鼠胚胎成纤维细胞的增殖并无重要作用，这表明NKAP在不同类型细胞的不同复合物中发挥作用。同年，该研究团队NKAP缺陷时，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKI) p19 Ink4d和p21 Cip1的表达增加，NKAP可能会限制引发细胞周期停止或细胞死亡的细胞应激反应，从而导致细胞周期缩短或细胞死亡，该研究结果也证明NKAP对维持造血干细胞的存活至关重要 [12] 。

2.3. NKAP与有丝分裂、RNA剪接、DNA损伤及转录调控的关系

R环(R-loop)是指当某些基因转录形成mRNA分子难与模版链分离时，会形成RNA-DNA杂交体，这时非模板链与RNA-DNA杂交体共同构成R环结构。持续的R-loop积累会导致DNA损伤，导致基因组不稳定，从而导致各种人类疾病。Zhang Xing等人 [13] 发现NKAP缺失导致DNA损伤和基因组不稳定。R-环的异常积累存在于NKAP缺失的细胞中，并导致DNA损伤和DNA复制叉进展缺陷。NKAP相互作用蛋白HDAC3在抑制R-loop相关的DNA损伤和复制应激中也表现出类似的作用。进一步的分析发现，HDAC3功能稳定NKAP蛋白是不依赖于其去乙酰化酶活性的。以上结果表明NKAP和HDAC3都是R-loop稳态的新关键转录调控因子，它们的异常调控可能通过引起R-loop相关基因组的不稳定来驱动肿瘤的发生。Sarah K. Fiordaliso等人 [14] 报告了一种由于X染色体基因NKAP错义突变导致的转录调控紊乱。该研究发现这些突变聚集在NKAP的c端区域，NKAP与HDAC3和催化后剪接体复合体蛋白相互作用。患者则出现包括发育迟缓、张力减退、关节挛缩、行为异常、马方样畸形和脊柱侧凸等临床特征。以上观察结果表明NKAP在转录调控中具有关键作用，并表明干扰NKAP的c末端区域会导致人类发育缺陷。染色体精确分离需要染色体对齐，而染色体错位可导致基因组不稳定和肿瘤的发生。Teng Li等人 [15] 发现NKAP在有丝分裂过程中被泛素化，NKAP敲除导致人类细胞染色体错位和前中期阻滞，而泛素化是NKAP与着丝点蛋白E (CENP-E)所必需的，NKAP动态地定位于着丝点也是CENP-E定位所必需的，这对染色体的排列至关重要。其研究结果也表明NKAP是一种新的、关键的有丝分裂调控因子，其异常调控可能通过引起染色体不稳定而导致肿瘤的发生。在RNA的剪接和加工方面，Bhagyashri D. Burgute等人 [16] 的研究表明NKAP能够与RNA结合蛋白、RNA解旋酶和剪接因子相互作用，在RNA的剪接和加工中发挥重要作用。

2.4. NKAP与肿瘤的关系

随着研究的深入，NKAP与肿瘤疾病的关系受到越来越多的关注。吸烟是肺癌发展的主要危险因素，Liu J等人 [17] 研究发现在吸烟相关的肺癌中，肉豆蔻酰化富丙氨酸C激酶底物(myristoylated alanine-rich C kinase substrate, MARCKS)与NKAP合作激活NF-κB信号通路。MARCKS在气道上皮细胞和肺癌细胞中被激活，且MARCKS蛋白直接与NKAP结合。在MARCKS ser159和ser163位点磷酸化后，MARCKS-NKAP相互作用受到抑制，导致NF-κB信号通路的激活。该研究还证实了磷酸化MARCKS (phospho-MARCKS)与磷酸化NF-κB (phospho-NF-κB, phospho-p65)呈正相关，吸烟诱导的phospho-MARCKS上调了促炎细胞因子的表达、上皮间质转化。相反，用一种特异性的MARCKS磷酸化抑制剂靶向MARCKS磷酸化，可抑制烟雾介导的NF-κB信号通路活性、促炎细胞因子表达、肺癌细胞的侵袭性 [17] 。近年来，肺炎的发病率不断上升，Liu M等人 [18] 通过对长链非编码RNA MIAT (lncRNA MIAT)在脂多糖(LPS)诱导的肺炎中的作用这一研究发现MIAT缺失可通过调控miR-147a/NKAP来保护LPS诱导的肺部炎症。lncRNA MIAT在LPS诱导的肺部炎症中表达上调，LPS诱导小鼠MIAT升高，sh-MIAT能抑制LPS诱导的炎症反应，抑制细胞凋亡，保护肺功能。siMIAT能消除LPS对小鼠肺上皮TC-1细胞的损伤，抑制NF-κB信号通路的激活。此外，MIAT作为miR-147a的海绵，miR-147a直接靶向NKAP。Yun Jun等人 [19] 认为暴露于氧化铝纳米颗粒(Aluminum oxide nanoparticles, Al₂O₃ NPs)与肺部炎症有关.该团队利用miRNA芯片对暴露于Al₂O₃ NPs的人支气管上皮(human bronchial epithelial, HBE)细胞中的microRNA (miRNA)表达谱进行了表征。在差异表达的miRNA中，miR-297在暴露于Al₂O₃ NPs后，与对照组相比，显著上调。同时结合生物信息学分析、蛋白质组学分析和mRNA微阵列分析，发现NKAP是miR-297的靶基因，且与对照组相比在Al₂O₃ NPs暴露的HBE细胞和小鼠肺中，NKAP显著下调。除了成人相关肺炎，小儿肺炎(Infantile pneumonia, IP)对儿童健康造成的负担越来越重。研究表明 [20] 长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA) LINC00707参与了肺炎过程的调控。LINC00707缺失可通过调节miR-382-5p/NKAP轴，减轻LPS触发的WI-38细胞损伤，该研究结果为IP提供了一种新的治疗策略。肝细胞癌(hepatellular carcinoma, HCC)是世界范围内威胁生命最严重的肿瘤之一，肝癌的发病机制有多种因素，如乙型/丙型肝炎病毒感染、酗酒、肝硬化、基因突变等 [21] 。尽管肝移植、经皮消融等治疗策略取得了很大的进展，但肝癌患者的生存率仍然很低。Song T等人 [22] 的研究首次揭示了NKAP通过AKT信号通路在HCC中发挥致癌作用。该研究发现NKAP在HCC组织中高表达，并与患者生存不良相关。NKAP的下调显著降低了HuH7和Hep3B肝癌细胞系的细胞活力。敲除NKAP能显著抑制HuH7和Hep3B细胞的细胞侵袭(p < 0.05)。下调NKAP的HuH7细胞和Hep3B细胞凋亡率显著升高。敲低NKAP可降低AKT的磷酸化水平及其下游成员p70S6K和Cyclin D1的表达。有研究发现NKAP在结肠癌中也发挥相似的促癌作用。Shu WB等人的研究 [23] 首次揭示了NKAP在结肠癌中表达上调，并在结肠癌的发生发展中发挥致癌作用，敲低NKAP可抑制结肠癌细胞的增殖和侵袭，促进细胞凋亡和自噬。一些特定的microRNA可以在转录后水平调控胃癌细胞的基因表达。Wei Yaining等 [24] 发现miR-4766-5p在胃癌组织和细胞系中表达下调，并可显著抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。该研究还表明miR-4766-5p通过靶向NKAP和抑制AKT/mTOR信号通路抑制胃癌细胞的增殖和转移。He Yuxin等人 [25] 在对外泌体的研究中发现，环状RNA (circular RNAs, circRNAs)配对相关同源框1 (circRNA paired-related homeobox 1, circPRRX1)可以通过来自胃癌细胞的外泌体转移。该研究数据显示circPRRX1在人胃癌中表达升高。circPRRX1直接调控miR-596的表达，外泌体circPRRX1至少部分通过miR-596影响细胞生物学功能且NKAP被鉴定为miR-596的直接靶点和功能下游效应因子。外泌体circPRRX1作为miR-596的竞争性内源性RNA (competing endogenous RNA, ceRNA)调节NKAP的表达。胰腺癌以胰管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)为主，其5年生存率通常小于5%，是一种致命的恶性肿瘤。N6-甲基腺嘌呤(N6-Methyladenosine, m6A)修饰，miRNA加工和成熟的重要机制，参与多种疾病的异常调控 [26] 。研究发现 [27] ，胰腺癌上皮细胞中的原发性microRNA-25 (miR-25)可以通过NKAP介导的m6A修饰增强而被香烟烟雾凝结物(cigarette smoke condensate，CSC)过度成熟。这种修饰由过表达的甲基转移酶3 (methyltransferase-like 3, METTL3)催化，因为METTL3启动子的低甲基化也是由CSC引起的。成熟的miR-25，miR-25-3p，抑制PH域富亮氨酸重复蛋白磷酸酶2 (PH domain leucine-rich repeat protein phosphatase 2, PHLPP2)，导致AKT-p70S6K信号通路的激活，从而引发胰腺癌细胞的恶性表型。在吸烟者和与胰腺癌预后不良患者的胰腺癌组织中检测到过表达的miR-25-3p。这些结果共同表明，吸烟通过m6A修饰诱导miR-25-3p过度成熟促进胰腺癌的发生发展。Xu Xiangrong等人 [28] 的最新研究结果表明，NKAP在胰腺腺癌(pancreatic adenocarcinoma, PAAD)细胞株中高表达，敲除NKAP基因可显著抑制PAAD细胞的生物学功能，增加PAAD细胞凋亡、抑制PAAD细胞凋亡蛋白和细胞周期蛋白的表达水平。此外，mTOR的磷酸化程度及其下游靶蛋白p70S6K的表达均可被NKAP激活。该研究首次发现mTOR信号通路参与NKAP在PAAD中的致瘤作用并得出NKAP作为癌基因调控PAAD细胞发育这一结论。Ma Qian等 [29] 对肾细胞癌的研究发现敲低NKAP能强烈抑制Ketr-3和786-0细胞的增殖和运动，并诱导细胞凋亡。此外，通过western blot检测AKT/mTOR信号通路的相关蛋白发现敲低NKAP显著抑制cyclin D1的表达且抑制AKT和mTOR的磷酸化。该研究首次揭示了AKT/mTOR信号通路参与了NKAP在肾细胞癌中的致癌作用，为探索肾细胞癌的分子调控机制提供了重要依据。在尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma, ES)细胞中NKAP也通过AKT信号通路作为癌基因发挥作用。研究发现 [30] ，NKAP在ES细胞中高表达。敲低NKAP的ES细胞系A673和RD-ES，其侵袭和迁移能力被显著抑制。通过流式细胞术检测细胞凋亡发现NKAP敲低后凋亡ES细胞明显增加。该研究其他结果表明，NKAP下调导致AKT磷酸化和AKT信号通路下游效应因子cyclin D1表达降低。该研究揭示了NKAP通过AKT信号通路促进ES细胞增殖、迁移和侵袭，为NKAP在ES中的治疗应用提供了新的途径。在乳腺癌中NKAP也有类似的生理作用，Liu Jiangtao等人 [31] 发现NKAP在乳腺癌组织和正常组织中表达有差异，且NKAP是乳腺癌潜在的预后指标。NKAP的下调显著抑制了乳腺癌细胞系MCF-7的增殖和克隆。此外，敲低NKAP基因能强烈抑制MCF-7细胞的迁移和侵袭。进一步研究发现，在MCF-7细胞中NKAP影响AKT/mTOR信号通路，显著降低AKT、mTOR及其下游蛋白的磷酸化水平。该研究团队还发现CoCl2可以诱导MCF-7细胞中NKAP的表达。其中NKAP的下调通过调节AKT/mTOR信号通路抑制了CoCl2对MCF-7细胞增殖和侵袭的影响。Sun等发现 [32] NKAP敲除可诱导胶质母细胞瘤细胞死亡。在体外和体内，沉默NKAP增加了细胞对铁诱导物的敏感性。外源过表达NKAP通过正向调节铁离子防御蛋白胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白(SLC7A11)促进细胞对铁离子诱导物的抗性。NKAP对SLC7A11的调控可被m6A甲基化抑制剂环亮氨酸和METTL3削弱。因此，NKAP通过与m6A结合促进SLC7A11 mRNA的剪接和成熟，成为一种新的铁蛋白抑制因子。神经母细胞瘤(neuroblastoma, NB)的相关研究发现 [33] ，下调NKAP可显著抑制NB1和SK-NSH细胞增殖，促进细胞凋亡。此外，下调NKAP显著降低了p-PI3K和p-AKT的表达。该研究表明NKAP的下调通过抑制PI3K/AKT信号通路的激活在体外和体内发挥NB的致癌作用且NKAP的表达可能作为预测NB患者复发和染色体11q缺失的一种新的生物标志物。Guo Ting等人 [34] 研究发现dNKAP (果蝇NKAP的同源物)功能受损会导致果蝇上皮性肿瘤模型的基因组不稳定和致瘤性生长。dNKAP敲除会导致R-loop积累和DNA损伤。进一步的分析表明，在不同的细胞群中，dNKAP敲除可诱导c-JunN末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)依赖的凋亡，并引起细胞增殖的变化。Notch和JAK/STAT信号通路的激活有助于dNKAP敲除组织的致瘤性。此外，JNK信号通路在敲除dNKAP介导的细胞入侵中至关重要。敲除dNKAP基因和致癌基因Ras、Notch或Yki突变在驱动肿瘤发生中显示协同作用，进一步支持dNKAP的肿瘤抑制作用。因此，该研究结果表明dNKAP通过防止果蝇上皮基因组不稳定发挥抑瘤作用，从而为人类NKAP家族基因在肿瘤起始和发展中的作用提供了新的认识。

3. 总结

NKAP是一种高度保守的蛋白，具有多种功能，其在转录抑制、T细胞发育、成熟和功能获得、造血干细胞的维持和存活以及RNA剪接中发挥重要作用。随着研究的不断深入，有研究表明NKAP是一个癌基因，对细胞的增殖、侵袭、迁移有促进作用。进一步研究发现NKAP在肺炎、肺癌、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌等疾病的病情发展中发挥了重要的作用。但是，目前对NKAP的研究相对局限，因此，继续通过临床、体内、体外实验探索NKAP在不同疾病发生发展中的作用机制对疾病的诊治显得尤为重要。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。