摘要: 目的：观察糖调节受损大鼠模型胰岛β-细胞功能、胰岛素抵抗水平及胰腺组织中AMPK-mTOR信号通路相关蛋白表达水平变化。方法：选取82只雄性Wistar大鼠，采用高脂饲料饲养及腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ)建立糖调节受损(IGR)模型组，普通饲料饲养建立对照组，各组选6只检测血清样本中胰岛素、血糖、2小时后血糖含量，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)；利用Western-blot方法检测p-AMPK、p-mTOR、ULK1、LC3、Beclin-1。结果：与对照组比较，模型组大鼠血清FBG、FINS、2 h后血糖、HOMA-IR均升高，大鼠胰腺组织p-AMPK、p-mTOR、ULK1、LC3、Beclin-1表达均升高，差异有统计学意义(P < 0.05)。结论：IGR模型大鼠胰岛素抵抗明显、胰岛β细胞功能降低，AMPK-mTOR信号通路相关蛋白表达升高。
Abstract:
Objective: To observe the changes of pancreatic islet β-cell function, insulin resistance level and the expression level of AMPK-mTOR signaling pathway related proteins in pancreatic tissues in the im-paired glucose regulation rat model. Methods: 82 male Wistar rats were selected and fed with high-fat chow and intraperitoneal injection of small trick streptozotocin (STZ) to establish an im-paired glucose regulation (IGR) model group, and a control group was established by normal chow. 6 rats from each group were selected to test the serum samples for insulin, glucose, and glucose level after 2 hours, and calculate the insulin resistance index (HOMA-IR); p-AMPK-mTOR signaling pathway related proteins expression level in pancreatic tissues were detected by Western-blot was used to detect p-AMPK, p-mTOR, ULK1, LC3 and Beclin-1. Results: Compared with the control group, serum FBG, FINS, post-2h glucose, and HOMA-IR were elevated in the model group, and the expres-sion of p-AMPK, p-mTOR, ULK1, LC3, and Beclin-1 was elevated in the pancreatic tissues of the rats, and the difference had a statistical significance (P < 0.05). Conclusion: IGR model rats had obvious insulin resistance, reduced pancreatic β-cell function, and elevated expression of proteins related to AMPK-mTOR signaling pathway.
1. 引言
糖调节受损(Impaired Glucose Regulation, IGR)是指体内分泌的胰岛素不能够满足体内糖代谢的需要，从而出现有关糖代谢方面的调整一些紊乱。IGR是2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus, T2DM)的前期状态，尽管是处于糖尿病的初始阶段，血糖水平并没有达到糖尿病所规定的标准，仍可能导致有害的后果，且IGR与早期肾病、小纤维神经病变、早期视网膜病变以及心血管疾病的风险上升有关 [1] [2] [3] 。因此在糖尿病预防研究中，IGR人群的生活方式干预被视为核心内容及首要步骤 [4] [5] 。T2DM的早期阶段以胰岛素抵抗、胰岛β-细胞功能降低为主要生理病理特征 [6] ，因此IGR与两者关系密切。目前临床上通常以葡萄糖耐量试验(Oral Glucose Tolerance Test, OGTT)及胰岛素抵抗指数(Homeostasis Model Insulin Resistance Index, HOMA-IR)来评估胰岛功能。本研究旨在建立IGR大鼠模型，与正常对照组共同检测空腹胰岛素、空腹血糖、2小时后血糖含量评估胰岛功能，计算HOMA-IR评价胰岛素抵抗水平，同时检测有关AMPK-mTOR信号通路相关蛋白p-AMPK、p-mTOR、ULK1、LC3、Beclin-1，探讨糖调节受损对胰岛β-细胞功能、胰岛素抵抗水平的影响，及其与AMPK-mTOR信号通路的相关性。
2. 材料与方法
2.1. 仪器
电子天平(上海菁海仪器有限公司，DY15K)、精密电子天平(上海菁海仪器有限公司，FA2004N)、数显游标卡尺(得力，DL91150)、台式低速离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司、SF-TDL-5C)、恒温箱(上海精宏实验设备有限公司，DNP-9272)、恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司，DHG型)，血糖仪(罗氏)。
2.2. 试剂
链脲菌素(STZ，sigma公司，S0130-1G)、大鼠胰岛素(INS) ELISA Kit (华美公司，CSB-E05070r)、葡萄糖(GLU)试剂盒(葡萄糖氧化酶法) (南京建成，A154-1-1)、D-(+)-葡萄糖(sigma公司，D9434-250G)、二甲双胍盐酸盐(梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，M2009)、盐酸赛拉嗪注射液(圣达动物药品有限公司)、舒泰50 (法国维克，FBS060)。
2.3. 动物
82只雄性Wistar大鼠，购自杭州医学院动物实验中心，8~10周龄，体重200~250 g。饲养温度23℃± 3℃，相对湿度40%~70%。
2.4. 饲料
高脂饲料配方：脂肪占61%，蛋白质占19%，碳水化合物占20%。
2.5. 试验方法
2.5.1. 动物分组及饲养
将82只雄性wistar大鼠适应性喂养一周后，随机分为正常对照组12只(正常饲养)、IGR模型组70只(普通饲料适应性喂养1周后，体重约为200~250 g，继续给予高脂饲料喂养4周) (饲料配方：脂肪占61%，蛋白质占19%，碳水化合物占20%)，每3天腹腔注射链脲佐菌素25 mg/kg (pH 4.45、0.01 mol/L无菌柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液) 1~2次。
2.5.2. 模型建立
注射第三天链脲佐菌素检测大鼠空腹血糖和糖耐量(OGTT)实验(大鼠禁食不禁水16 h后，按照2 g/kg的剂量灌胃50%的葡萄糖溶液，注射葡萄糖后分别在0、2 h后隔尾取血检测血糖，并绘制葡萄糖耐量变化曲线)，以监测大鼠糖调节能力，当FBG为6.1~7.0 mmol/L，OGTT 2 h血糖值为7.8~11.1 mmol/L，视为IGR模型建立成功。
2.6. 样本收集
各组选取正常对照组、IGR模型组各6只大鼠；大鼠处死以后，收集腹腔动脉血 > 1~2 ml，分离血清，保存于−80℃。大鼠处死12 h之前禁食，收集胰腺组织，在液氮速冻后，−80冻存。
1) 使用大鼠胰岛素(INS) ELISA实验方法试剂盒检测各组大鼠血清样本中胰岛素量，按照试剂盒说明测定大鼠空腹葡萄糖(FBG)，进行空腹葡萄糖耐量试验(OGTT)并记录服糖后2 h后的血糖值。用公式HOMA-IR = FBG (空腹血糖) × FINS (空腹胰岛素)/22.5计算HOMA-IR，评价胰岛素抵抗。
2) 提取各组大鼠胰腺组织总蛋白，Western-blot方法检测AMPK，p-AMPK，mTOR，p-mTOR，ULK1，LC3，Beclin-1蛋白表达。样本经液氮研磨之后，取约100 mg样本加入到预冷的1.5 ml离心管中，然后加入400 μL RIPA裂解液(已加入蛋白酶抑制剂和广谱磷酸酶抑制剂)，充分混匀，4℃放置60 min后，12,000 rpm，4℃，离心15 min收集上清。BCA法测定蛋白浓度。样本加入适量5 × SDS-PAGE loading buffer (含β-巯基乙醇)，100℃沸水加热处理5 min，使蛋白充分变性，12,000 rpm离心5 min，取上清备用。后制胶、加样、电泳，电泳结束后转膜，再将PVDF膜水洗3次(5 min/次)，使用含5%脱脂奶粉的封闭液，封闭转印膜1 h，然后TBST洗3次(5 min/次)，用TBST稀释一抗，漂洗3次，加入适当稀释的二抗室温孵育1 h，再漂洗3次，(15)将显色液A液和B液混合，加2 ml至膜上，用ChemiScope mini化学发光仪检测、拍照。
2.7. 统计学处理
所有数据采用均值 ± 标准差表示，运用SPSS19.0软件对各组中各蛋白含量进行统计学分析，组间分析采用T检验分析方法统计，P < 0.05表明有显著性差异。
3. 结果
1) 模型组与对照组间血清中FBG、FINS、2 h后血糖、HOMA-IR的比较与对照组相比，IGR模型组大鼠血清中含量FBG、FINS、2 h后血糖及HOMA-IR均明显升高，差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表1。
2) 模型组与对照组间AMPK-mTOR信号通路相关蛋白表达水平的比较与对照组相比，IGR模型组大鼠胰腺组织中p-AMPK、p-mTOR、ULK1、LC3、Beclin-1的表达水平均明显升高，差异均有统计学意义(P < 0.05)，见表2、表3。
Table 1. Statistics of GLU and INS levels in serum of each group (
, n = 6 )
表1. 各组血清中GLU、INS含量统计表(
)
注：△与对照组相比，P < 0.05。
Table 2. Analysis of the expression level of each protein in rat pancreatic tissues (
, n = 4 )
表2. 大鼠胰腺组织中各蛋白的表达水平分析(
)
注：△与对照组相比，P < 0.05。
Table 3. Analysis of the expression levels of each protein in the pancreatic tissues of different groups of rats (
, n = 4 )
表3. 不同分组大鼠胰腺组织中各蛋白的表达水平分析(
)
注：△与对照组相比，P < 0.05。
4. 讨论
IGR是糖尿病发生早期出现的糖代谢紊乱，是糖尿病发生发展过程中重要的病理生理状态。但针对IGR发生过程中，是否导致胰岛素抵抗的发生、胰岛β-细胞功能的受损，是否引起信号通路的改变尚未明确，本实验通过高脂饲料喂养及腹腔注射小剂量STZ的方法成功建立IGR模型，并通过检测血清中空腹胰岛素、空腹葡萄糖、2 h后血糖及胰腺组织中p-AMPK、p-mTOR、ULK1、LC3、Beclin-1表达水平的变化，证明在IGR可以导致胰岛素抵抗及胰岛β-细胞功能受损，且在这一过程中AMPK-mTOR信号通路相关蛋白表达水平明显升高。
AMPK-mTOR是与细胞自噬密切相关的信号通路，可诱导细胞自噬的发生 [7] 。自噬是一种细胞膜上的部分胞质和细胞需要降解的细胞器、蛋白质等组成自噬体的过程。细胞自噬可以维持细胞的稳定状态并实时更新细胞器。近年来有研究者表明，肥胖型2型糖尿病的发生与自噬功能的变化密切相关，这是因为细胞自噬功能对胰岛β-细胞功能及胰岛素抵抗的进展产生了影响 [8] 。胰岛β-细胞缺乏自噬功能可导致细胞增殖能力下降、死亡增加、体积减少、胰岛素含量下降和葡萄糖刺激胰岛素分泌减少，导致糖调节受损、糖尿病。因此适当增加自噬可以有效地缓解胰岛素抵抗。缺乏AMPK会增加ULK1信号传导及LC3的脂化 [9] 。Beclin-1作为一种自噬相关蛋白，是酵母自噬相关基因在哺乳动物中的同源物 [10] 。它是自噬的正调控因子，主要调节其他自噬相关蛋白在自噬体膜上的聚集，从而控制自噬体的形成和自噬活性 [11] 。从本实验的结果中可以推断，IGR发生后，大鼠空腹系统、空腹胰岛素水平均明显升高，胰岛素抵抗明显，同时胰腺组织中的p-AMPK、p-mTOR、ULK1、LC3、Beclin-1表达水平均显著升高，提示IGR的发生发展，与AMPK-mTOR信号通路诱导的细胞自噬密切相关，虽IGR分子机制尚未明确，但这一发现，为临床上早期预防及治疗2型糖尿病制定新的策略，提供科学依据。
基金项目
省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室开放课题(SKL-HIDCA2021-DX4)。
NOTES
*通讯作者。