原发性胆汁性胆管炎患者血清MicroRNA的表达谱分析

Analysis of Serum MicroRNA Expression Profile in Patients with Primary Biliary Cholangitis

摘要: 目的：研究原发性胆汁性胆管炎(Primary biliary cholangitis, PBC)患者血清中microRNAs的差异表达与临床价值。方法：首先，采用高通量测序筛选PBC组和正常对照组中差异表达的miRNAs，其次，采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)对差异表达的miRNAs在扩大样本中进行验证。最后，预测miRNAs的靶基因。结果：高通量测序筛选出94条miRNAs，其中，60条miRNAs表达上调，34条miRNAs表达下调。经过qRT-PCR验证发现miR-410-3p在PBC组中的表达水平明显高于正常对照组，与测序结果一致。靶基因预测结果提示，miR-410-3p的相关靶基因与T细胞或B细胞的分化、活化、增殖、稳态相关。结论：PBC患者血清中存在差异表达的miRNAs，miR-410-3p对PBC的诊断有一定的参考价值。

Abstract: Objective: To investigate the differential expression and clinical value of microRNAs in the serum of patients with primary biliary cholangitis (PBC). Methods: First, high-throughput sequencing was used to screen differentially expressed miRNAs in PBC group and normal control group. Second, qRT-PCR was used to verify the differentially expressed miRNAs in expanded samples. Finally, computer analysis was conducted to predict target genes. Results: By high-throughput sequencing, we found 94 miRNAs were differentially expressed in PBC patients compared to the normal controls. The analysis identified 60 up-regulated miRNAs (>2.0-fold) and 34 down-regulated miRNAs (<0.5-fold). qRT-PCR verified that the expression of miR-410-3p was significantly up-regulated in PBC patients compared with the normal controls, which was consistent with the deep sequencing results. The prediction results of target genes suggested that the related target genes of miR-410-3p were involved in the differentiation, activation, proliferation and homeostasis of T cells or B cells. Conclusion: There are differentially expressed miRNAs in the serum of PBC patients. miR-410-3p has certain reference value for the diagnosis of PBC.

1. 引言

原发性胆汁性胆管炎(Primary biliary cholangitis, PBC)是一种自身免疫性肝病，以肝内中、小胆管进行性破坏，非化脓性炎症为主要病理特征 [1]。PBC主要为中年女性多发 [2]。病因学上，目前认为PBC可能是易感基因、环境危险因素和免疫紊乱相互结合作用的结果 [3]。然而，PBC确切的发病机制尚不清楚。临床上以血清中出现特异性的抗线粒体抗体(AMA)为主要诊断依据，但是仍有5%~10%的PBC患者AMA为阴性 [4]。MicroRNAs (miRNAs)是一组长度为21~23个碱基的小RNA分子，通过对靶基因的调控，参与细胞分化、细胞增殖和细胞凋亡等重要的生物过程 [5] [6]。越来越多的证据表明，在不同的肝脏疾病中miRNAs的表达谱是不同的，有助于疾病的早期诊断和治疗。最近的研究集中于PBC患者肝组织和外周血PBMC中特定的miRNAs表达谱。除此之外，PBC患者的血清中一些miRNAs也已被证明表达失调 [7]，这意味着miRNAs可能在PBC疾病发病机制中发挥一定的作用。本研究应用高通量测序研究PBC患者血清miRNAs的差异表达，旨在丰富PBC血清miRNAs表达谱，通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)验证差异表达的miRNAs，并探讨其临床价值。

2. 对象与方法

2.1. 对象

选取2020年12月至2021年7月于青岛大学附属医院就诊并临床确诊的PBC患者82例为病例组，男6例，女76例，平均年龄(57.2 ± 11.0)岁。另外选取性别、年龄与PBC患者相匹配的20名健康体检者为正常对照组，20名慢性乙型肝炎(CHB)患者作为其他疾病对照组。具体临床资料见表1。实验方案经青岛大学附属医院伦理委员会批准。所有入院患者均签署青大附院“临床样本开展科学研究知情同意书”。

2.2. 标本收集

PBC组和对照组均于清晨空腹抽取外周静脉血2 mL，4500×g离心10 min分离上层血清，保存在−80℃超低温冰箱中。

2.3. 实验方法

2.3.1. 总RNA提取与文库构建

用于高通量测序的仪器名称为Illumina NextSeq 500 (美国Illumina公司)。使用Trizol LS试剂(美国Invitrogen公司)从3名PBC患者和3名正常对照250 µL血清样本中提取总RNA。使用NanoDrop ND 2000 (美国赛默飞公司)对总RNA进行定量分析。抽提所得的总RNA经Agilent 2100 Bioanalyzer (美国安捷伦生物科技公司)电泳质检合格后备用。miRNA文库构建采用Illumina Truseq Small RNA Preparation Kit试剂盒(LC Sciences)。总RNA链接5'接头和3'接头后经RT-PCR扩增形成小分子RNA的cDNA文库，经6%电泳缓冲液变性胶电泳分离，将长度为47 bp的小分子RNA切胶回收。

2.3.2. 高通量测序

cDNA纯化后经Illumina’s Cluster Station生成DNA簇，然后行Illumina GA II x测序。通过SCS v2.8软件实时分析测序图片，单端序列为32mer，并且使用RTA v1.8.70提取碱基信息。提取的原始序列利用ACGT101-miR v4.2 (LC Sciences)软件分析，生成原始数据库。为保证筛选到高质量的基因结果，剔除可比对离列数 < 10的基因。最后分析PBC组和正常对照间差异表达的miRNAs。

2.3.3. 靶基因预测

采用软件TargetScan数据库和miRDB数据库共同进行靶基因预测。

2.4. 差异表达miRNA的qRT-PCR验证

除了高通量测序的样本外，更多的PBC，CHB以及正常对照的血清样本被用于qRT-PCR实验验证，总共各组分别为PBC：82例；CHB：20例；正常对照：20例。采用TaqMan法对成熟miRNA的表达水平进行检测。首先从300 µL的血清中提取miRNA，后执行加多聚腺苷酸尾反应，然后按照制造商的方案使用HG TaqMan miRNA RT kit逆转录试剂盒(哈尔滨新海基因公司)合成cDNA。使用QuantStudio Dx Real-time PCR系统(美国ABI公司)和HG TaqMan miRNA qPCR试剂盒(哈尔滨新海基因公司)，在20 µL的PCR反应体系中检测目的miRNA。PCR反应体系为 Golden HS TaqMan qPCR Mix 4 µL，引物和探针总共1 µL，cDNA模板2 µL，ROX染料0.4 µL，无RNA酶水补充体积至20 µL，混匀后置于冰上。对于目的基因hsa-miR-410-3p，我们使用以下引物：正向引物序列：5'-CGCGCGAATATAACACAGATG-3'；反向引物序列：5'-GAGAACAGCTCTGTGTTATAT-3'。设置循环反应程序为：95℃预变性15 min，95℃变性10 s，60℃退火与延伸60 s，总共40个循环。反应产物经熔解曲线检测特异性。经SDS2.2软件分析循环域值(CT值)。以hsa-miR-16作为内参，采用2^−ΔΔCt法计算miRNA的表达，具体计算方法为：ΔΔCT = ΔCT (患者) − ΔCT (健康对照)，ΔCT = CT (靶基因) − CT (内参基因)。

2.5. 测序数据分析和统计学分析

PBC组和正常对照组差异表达miRNAs采用统计学Mann-Whitney U检验。采用MeV4.6软件进行PBC组和正常对照组差异表达miRNAs的聚类分析，P < 0.05表示差异有统计学意义。采用Graphpad Prism 6.0软件或者IBM SPSS 22.0软件进行统计分析处理，对各组计量资料进行正态分布检验。正态分布的计量资料采用均数 ± 标准差( $\bar{X}\pm S$ )表示，组间比较采用单因素方差分析。非正态分布的计量资料采用中位数(M)和四分位数间距(P25, P75)表示，组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。以ROC曲线及AUC分析评估血清miRNAs对PBC的诊断价值，P < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. 临床和实验室特征

PBC组与CHB组、正常对照组的基本临床和实验室特征见表1。结果显示：PBC组的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰转肽酶(GGT)、直接胆红素(DBil)表达水平明显高于正常对照组，但白蛋白水平低于正常对照组(P均 < 0.05)。三组患者的性别和年龄差异无统计学意义。

Table 1. Clinical and laboratory characteristics of PBC group, chronic hepatitis B group, and normal control group

表1. PBC组、CHB组和正常对照组的临床和实验室特征

注：^*与正常对照组比较(P < 0.05)；^#与CHB组比较(P < 0.05)。NS：无统计学意义。

3.2. 高通量测序结果分析

通过高通量测序可以发现，PBC组与正常对照组相比，总共有94个miRNAs表达有差异，其中表达上调(FC > 2)的有60个miRNAs，表达下调(FC < 0.5)的有34个miRNAs；其中|log₂FC| > 8的成熟miRNAs共有6个，其中表达上调的miRNAs有5个，表达下调的miRNAs有1个，见表2。通过分析发现miR-410-3p在3名PBC患者中均有表达，且表达量较高，因此我们选择miR-410-3p进行后续研究。

Table 2. There are 6 miRNAs that their |log2FC| more than 8 times between PBC group and normal control group

表2. PBC组与正常对照组间|log₂FC| > 8倍的有6个miRNAs

注：*：用于后续实时荧光定量PCR验证的miRNA。

3.3. 实时荧光定量PCR验证

采用实时定量PCR对82例PBC患者(包括前面进行测序实验的3例患者)、20例正常对照和20例慢性乙型肝炎患者进行实验验证。验证结果显示，与正常对照组和慢性乙型肝炎患者相比，PBC组中的miR-410-3p表达水平明显上调。见图1。

注：Control：正常对照；PBC：原发性胆汁性胆管炎；CHB：慢性乙型肝炎。纵坐标为miR-410-3p的血清相对表达量。^****P < 0.0001。

Figure 1. The differential expression of miRNAs was verified by real-time quantitative PCR

图1. 实时荧光定量PCR验证miRNAs的差异表达

3.4. 血清miR-410-3p对PBC的诊断价值

绘制ROC曲线评估PBC患者血清中miR-410-3p的临床价值。血清miR-410-3p在鉴别诊断PBC组和正常对照组时曲线下面积为0.775 (0.688~0.862)，当miR-410-3p最佳临界值为1.44时，敏感度为64.6%，特异度为95.0%。此外，血清miR-410-3p在评价PBC组和CHB组时曲线下面积为0.791 (0.695~0.887)。当miR-410-3p取最佳临界值为1.31时，敏感度为80.5%，特异度为70.0%。见图2。

(a) (b)注：(a)为miR-410-3p在鉴别诊断PBC组和正常对照组时的ROC曲线；(b)为miR-410-3p在鉴别诊断PBC组和慢性乙型肝炎组时的ROC曲线。

Figure 2. ROC curve of serum miR-410-3p for diagnosis and differential diagnosis of PBC

图2. 血清miR-410-3p诊断及鉴别诊断PBC的ROC曲线

3.5. 靶基因预测

对经qRT-PCR验证表达下调的miR-410-3p进行靶基因预测。通过TargetScan和miRDB数据库分析发现miR-410-3p共有539个靶基因，其中一些重要的靶基因与T细胞或B细胞的分化、活化、增殖、稳态等相关，一些靶基因与肝纤维化的发生和发展密切相关，见miRNA-靶基因网络图，图3。

Figure 3. miRNA-target genes network of miR-410-3p

图3. miR-410-3p的miRNA-靶基因网络图

4. 讨论

已知miRNA是一种内源性的、非编码的小RNA分子，长度约为21~23个核苷酸。miRNA通过与下游mRNA的3-UTR区域不完全互补结合，从而抑制靶基因的转录和翻译，在转录后水平调节基因的表达 [5] [6]。miRNA参与细胞分裂，细胞分化，细胞增殖，细胞凋亡，癌变和免疫功能等许多重要的生物学过程。与其他自身免疫性疾病相似，最近的研究集中于PBC患者肝组织和外周血PBMC中特定的miRNAs表达谱。例如，有研究发现miR-139-5p在肝脏组织中明显上调，其高表达miR-139-5p后，其靶基因c-FOS蛋白的表达明显降低，TNF mRNA及TNF表达显著升高，这表明miR-139-5p可能通过核因子-kB (NF-kB)信号通路参与了PBC的炎症调节过程 [8]。另一项研究发现PBC患者胆管上皮细胞中miRNA-506表达上调，与阴离子交换蛋白2 (anion exchanger 2, AE2)和肌醇1,4,5-三磷酸受体3 (type III isoform of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor, InsP3R3)的活性降低有关，最终导致细胞内Ca²⁺信号传导和胆汁碳酸氢盐分泌减少，从而引发胆汁淤积 [9]。

PBC是一种病因不明的自身免疫性肝病，其病理特征为肝内中、小胆管的进行性破坏，引起非化脓性胆管炎症，最终导致肝纤维化，肝硬化甚至肝衰竭。目前肝脏穿刺活检仍是诊断PBC的金标准，但组织活检是有创性检查，不能作为早期诊断PBC的首选检查。最近研究发现，PBC患者的外周血中也能检测到miRNAs [7] [10]，这些结果提示外周血miRNAs的检测有助于对疾病的早期诊断，预后评估甚至治疗反应监测。

本研究运用高通量测序技术筛选PBC患者和正常对照组间差异表达的miRNAs，发现共有94个miRNAs表达失调，其中60个miRNAs表达上调，34个miRNAs表达下调。用实时荧光定量PCR对miR-410-3p进行验证，结果提示，与正常对照、慢性乙型肝炎患者相比，miR-410-3p的表达水平显著上调。通过靶基因预测，本研究发现miR-410-3p的一些靶基因与T细胞或B细胞的分化、活化、增殖、稳态相关，如Ets-1 (E26 transformation-specific-1)是Th17细胞和B细胞分化的负向调控因子 [11]。Ets-1的缺失促进Th17细胞的分化和IL22、IL23受体的过表达。此外，Ets-1缺失可促使B细胞最终分化为分泌免疫球蛋白M (IgM)和免疫球蛋白G (IgG)的浆细胞 [12]。据报道，miR-410-3p在多种疾病中异常表达，包括癌症和自身免疫性疾病，调控细胞增殖、侵袭和迁移、凋亡与分化等多种生物学过程。有研究表明，miR-410-3p在肺癌和结直肠癌中显著上调，增强了癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力 [13] [14]。先前的研究表明，miR-410-3p在滑膜组织中表达水平明显下调，miR-410-3p通过调节类风湿性关节炎中的NF-kB信号通路，抑制成纤维细胞样滑膜细胞的细胞因子释放 [15]。然而，miR-410-3p与PBC之间的关系尚未阐明。 因此，本研究首次提出miR-410-3p与PBC之间可能存在联系。

PBC是一种免疫介导的慢性炎症性胆汁淤积性肝病，临床症状与普通慢性肝病相似，临床上一般以血清中检测出抗线粒体抗体(AMA)伴随碱性磷酸酶(ALP)升高为主要诊断依据。通过ROC分析，结果提示，血清miR-410-3p在诊断及鉴别诊断PBC和正常对照时，敏感度为64.6%，特异度为95.0%；miR-410-3p在区分PBC和慢性乙型肝炎时，敏感度为80.5%，特异度为70.0%。miR-410-3p对PBC可能有一定的诊断和鉴别诊断价值。但是miR-410-3p在个体之间的高度可变性或使用miRNAs进行临床诊断的方法标准化问题可能限制了miR-410-3p作为诊断性生物标志物的应用，还需要进行大样本和多中心的研究来验证。

5. 总结

综上所述，本研究通过检测PBC患者血清中差异表达的miRNAs，进一步丰富了PBC患者的血清miRNAs表达谱。血清miR-410-3p表达上调可能对PBC具有诊断价值。

基金项目

青岛大学附属医院青年科研基金资助项目(20141201)。

利益冲突

本人与其他作者宣称没有任何利益冲突，未接受任何不当的职务或财务利益。

作者贡献声明

徐田田负责样本收集、实验验证、数据分析整理和文章撰写；王战参与样本收集和实验验证；李文帅参与样本收集和数据整理；刘明军负责课题总体设计和文章修改。

NOTES

^*通讯作者Email: [e-mail]