1. 引言
类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一种以关节滑膜为主要靶组织,病因尚未完全明了的慢性异质性系统性疾病,初期主要表现为关节滑膜炎、后累、关节软骨及软骨下骨,其次为浆膜、心、肺等结缔组织的广泛性炎症,严重影响了患者生活质量和寿命 [1]。目前主要治疗RA的药物有非甾体类抗炎药、改善病情抗风湿药、糖皮质激素、生物制剂,此类西药具有耐药性、价格昂贵、副作用大等缺点 [2] [3] [4] [5]。
相关研究表明,单靶点药物治疗复杂疾病的作用有限,因此药物开发的模式已从单一靶点转向多靶点 [6] [7]。联合治疗的模式在西方开始受到关注,人们正尝试用复方用药来治疗复杂疾病 [8]。中药具有资源丰富、副作用小、价格低的优点 [9],且对类风湿关节炎的治疗具有良好效果,已引起国内外医学界的广泛关注。近年来,从中药中寻找药物先导化合物已成为创新药物研究的重要途径,全世界推出的所有小分子新化学实体药物中,63%可追溯到天然产物,天然产物至今仍是药物先导化合物发现的重要源泉,而且在今后的创新药物发现中还将发挥愈加重要的作用 [10]。中医对类风湿的认识和治疗,早在很久就有记录。如《黄帝内经》中已经对于风湿骨病有了比较系统和完整的介绍及治疗方法。通过查阅大量文献以及中药标准收集了与类风湿性关节炎相关的相关方剂,并结合文献阅读搜集针对类风湿性关节炎有效的中药分析,发现红花(Carthamus tinctorius L.)使用频率较高。红花为菊科植物红花的管状花,从红花中得到的化学成分包括黄酮、生物碱、聚炔、亚精胺、木脂素、倍半萜、有机酸、留醇、烷基二醇和多糖等 [11]。红花为主要活血化淤的中药之一,常用于血脉闭塞、跌打损伤、疮疡肿痛等证 [12]。
网络药理学作为对中药作用机制研究的新方法,结合了系统生物学、生物信息学、计算生物学等新兴学科,可在系统水平上分析中药药物的作用机制、识别新靶点和拓展新适应症,为复杂疾病和天然产物的药物发现提供支撑,并在相关研究中广泛应用。已有研究表明,郑春松 [13] 等通过网络药理学揭示白芍治疗类风湿关节炎的作用机制以及交泰丸抗抑郁作用的分子作用机制。此外,分子对接技术主要是用于研究蛋白质受体和药物小分子之间的相互作用,并通过结合能的大小来评判药物性能的研究方法 [14]。为此,本文拟采用网络药理学方法和分子对接技术阐明红花关键作用靶点及抗炎作用机制,为深入探究红花的抗RA作用提供了参考依据。
2. 方法
2.1. 红花活性成分与潜在靶点筛选
本研究采用中药系统药理学分析平台(TCMSP, http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索红花的全部化学成分,根据口服生物利用度(OB) ≥ 30%和类药性(DL) ≥ 0.18筛选红花的活性成分 [15],并建立相应的活性成分、作用靶点数据库。
2.2. RA疾病靶点的确定
在GeneCards数据库(http://www.genecards.org/)中进行检索,限定物种为“Homo sapiens”,导出GeneCards-SearchResults.csv,获取RA的相关作用靶点。
2.3. 成分–靶点网络构建
通过绘制韦恩图获得红花-RA的共同靶点,利用Cytoscape3.8.2软件构建“活性成分–作用靶点”网络,通过介数、度值等数值进一步评价红花中较为重要的活性成分与作用靶点。
2.4. 蛋白相互作用网络(PPI)的构建
将红花-RA共同作用靶点导入STRING (https://string-db.org/)数据库中,设置结合分数combined score > 0.9,并隐藏网络中游离的节点,其他参数为默认值,将得到的结果以文本形成导入Cytoscape3.8.2软件中进行可视化,根据Degree值绘制蛋白互作网络图 [16]。
2.5. GO功能和KEGG通路富集分析
利用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对红花和RA共同作用靶点蛋白进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。其中GO功能富集分析主要用于描述红花的靶点蛋白在基因功能中的作用,KEGG富集分析可以获得红花治疗RA显著富集的信号通路,设定p value Cutoff < 0.05,q value Cutoff < 0.05,取P值由小到大的前20个富集结果进行可视化展示 [17]。
2.6. 分子对接验证
采用软件Open Babel将红花的活性成分转换为pdbqt格式,然后通过ZINC12数据库(http://zinc12.docking.org/)搜索并下载类风湿性关节炎网络中关键作用靶点的蛋白三维结构,采用Autodock-vina软件对红花和关键靶点之间的相互作用关系进行验证,参数搜索空间设为25 × 25 × 25,exhaustiveness设为8,以原配体的重对接结果为阈值,以最低结合能为主要活性成分与关键靶点之间的对接结果。保存分子结果,并对其结合能(Binding affinity)进行分析,以评价网络分析预测的可靠性。
3. 结果
3.1. 红花活性成分与潜在靶点筛选结果
通过TCMSP数据库检索到红花中满足OB ≥ 30%,DL ≥ 0.18的活性成分22个,其基本信息见表1,作用靶点450个,去除重复靶点后剩余186个。
Table 1. Information on the active ingredients of Carthamus tinctorius L.
表1. 红花有效活性成分信息
3.2. RA疾病靶点筛选结果
以“rheumatoid arthritis”为关键词,在GeneCards数据库中进行检索,限定物种为“Homo sapiens”,导出GeneCards-SearchResults.csv,得到与RA疾病相关人类靶点4734个,其中选择与疾病关联度最高的400个。
3.3. 治疗RA化合物及潜在靶点筛选
通过韦恩图获得红花和RA的51个共同靶基因,见图1。51个基因对应化合物有14个,见图2。图2中紫色六边形节点代表化合物,绿色圆形节点代表基因靶点,一个节点的自由度表示网络中和节点相连接的边的数目。对图2进行拓扑分析可以看出,有3个化合物的作用靶点数量 > 20,分别为MOL000098槲皮素(44个),MOL000006木犀草素(23个),MOL000422山奈酚(20个),这些化合物有可能在治疗RA过程中起着重要的作用。
蓝色代表RA靶点;红色代表红花靶点;深红色部分为共同靶点
Figure 1. Venn diagram of the intersection of Carthamus tinctorius L.-RA targets
图1. 红花-RA作用靶点韦恩图
3.4. 成分–靶点网络构建
采用Cytoscape3.8.2软件构建化合物–疾病靶点互作网络,如图2所示。从图中可以看出,红花有效成分作用于51个靶点。运用Cytoscape软件中Network analyse功能对网络特征进行分析,重点观察网络度和介数高的节点。PTGS2、PTGS1、PPARG、JUN、BCL2、HMOX1、MMP1、VEGFA、RELA、GSTP1这10个靶点的度值高,说明红花主要作用在这10个靶点上发挥抗RA作用。
3.5. 蛋白互作网络分析
将51个共同靶点导入STRING中,结果见图3 (图中线条粗细代表作用力强弱),将结果以文本形式导出,利用Cytoscape软件绘制PPI网络图,见图3。PPI网路中共有48个节点(靶点蛋白)、161条边(蛋白相互作用)。节点大小和颜色表示该节点度值的大小,节点越大,由黄色变红色对应的度值越大。边的粗细表示结合分数,边越粗结合分数值越大。结果表明,IL6、RELA、JUN、IL10靶点蛋白度值排名靠前,为4个关键靶点。
3.6. GO功能和KEGG富集分析结果
GO功能富集分析分为生物过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)三类。根据图4显著性程度P < 0.05 (P值由小到大)进行部分展示,GO分析结果提示红花-RA-基因的生物学过程(BP)显著富集在信号通路、药物的反应、凋亡过程、炎症反应、细胞因子的分泌调节、对脂多糖的反应、氧化还原过程等;分
Figure 2. Interaction diagram of compounds and disease targets
图2. 化合物–疾病靶点互作网络
Figure 3. Carthamus tinctorius L. gardenia active ingredient-RA PPI network diagram
图3. 红花活性成分-RA PPI网络图
Figure 4. Enrichment analysis of GO pathway
图4. GO功能富集分析图
Figure 5. Enrichment analysis of KEGG pathway
图5. KEGG通路富集分析图
子功能(MF)主要富集在蛋白结合、酶结合,锌离子结合、蛋白同源二聚体活性、蛋白激酶活性等。细胞组分(CC)主要富集在细胞外空间、细胞外基质、核、核染色质、质膜外侧、细胞外区域等。
KEGG富集分析得到通路121条,根据图5显著性程度P < 0.05并结合相关文献进行筛选,其中与疾病相关通路有89条,癌症的途径、乙型肝炎、癌症中的蛋白多糖、癌症中的转录失调、甲型流感甲型流感、肺结核,前列腺癌,类风湿性关节炎,丙型肝炎等等;炎症相关通路32条,TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、T细胞受体信号通路、甲状腺激素信号通路等等。分析结果表明,红花可能通过作用于这些通路起到防治RA的作用。
3.7. 分子对接验证
结合蛋白互作网络图与药物–靶点网络图分析发现两个图中红花有效成分与抗类风湿性关节炎作用相关度的关键靶点均出现JUN和RELA,所以本研究以JUN、RELA为关键靶点。通过ZINC12数据库(http://zinc12.docking.org/)搜索并下载关键靶点的蛋白三维结构,发现其中JUN和RELA均存在含有配体的靶点蛋白,因此选择这两个靶点蛋白与主要活性分子在AutoDockVina软件中进行分子对接验证。验证前首先判断vina对接程序是否适用于本研究中所使用的小分子体系,将共晶结构中的配体小分子提取出来,利用vina将小分子重新对接回蛋白口袋中,计算共晶结构中的配体与对接结果的均方根偏差值(RMSD值)。一般认为,RMSD值小于2.0Å时 [18],即认为利用这种对接程序计算得到的相互作用模式是可靠的。
红花活性成分与关键靶点对接结果见表2,一般认为,分子对接的结合能(Binding affinity) < 0,表明配体分子与受体蛋白能自发结合,本研究以原配体的结合能为阈值,结合能越小对接结果越好 [19]。研究结果表明,2个靶点蛋白经过自对接计算得到的RMSD值均小于2.0Å,即2个蛋白与配体的相互作用是可靠的,并且红花与2个靶点的对接结果均于原配体相似,说明红花与类风湿性关节炎的靶点有很好的结合作用,同时也验证了网络药理学研究结果的可靠性。
4. 讨论
4.1. 红花成分分析
红花为菊科植物红花的管状花,从红花中得到的化学成分包括黄酮、生物碱、聚炔、亚精胺、木脂素、倍半萜、有机酸、留醇、烷基二醇和多糖等。红花的化学成分主要为黄酮和脂肪油两大类,其中查耳酮类化合物红花黄色素为红花的主要有效成分。红花为活血化淤的主要中药之一,常用于血脉闭塞、跌打损伤、疮疡肿痛等症状 [11] [12]。通过研究发现在人体免疫系统对抗细菌入侵时,脂多糖(LPS)能够引起机体的免疫应答和炎症反应。一些研究表明,槲皮素对LPS引起的炎症反应具有抑制作用,司丽君 [20] 发现槲皮素具有选择性抑制COX-2、巨噬细胞炎症反应的作用,还能促进小鼠脾淋巴细胞的增殖,抑制T、B细胞的增殖来治疗RA作用。山奈酚 [21] 可通过阻断MAPK通路和生长因子受体3-核糖体S6激酶2信号轴,来发挥治疗RA作用。木犀草素 [22] 可以通过多种途径缓解炎症反应,其中包括减少活性氧和活性氮的生成,影响花生四烯酸的代谢和多种炎性信号通路(NF-κB信号通路;MAPK和AP-1信号通路;JAK和STAT信号通路)抑制炎性细胞因子和炎症介质的表达等。
4.2. 关键靶点分析
通过对红花-RA-基因网络分析可以发现,红花可作用于51个靶点,根据蛋白互作网络图与药物–靶点–作用通路图可发现,RELA等靶点均属于网络核心节点,说明这个靶点在红花抗RA作用中处于关键地位。
RELA是网状内皮增生病毒癌基因,RELA是NF-κB家族的重要成员。它通过对靶基因的调节,参与细胞的增殖与转化、凋亡、炎症以及免疫应答等重要的生命活动,同时这些功能受到磷酸化、乙酰化、甲基化等多种翻译后修饰的调控 [23]。NF-κB信号通路已被证实能激活上百种基因的表达,参与多种人体疾病进程,包括免疫调控、炎症反应及癌症的发生等方向,RELA作为NF-κB的一种亚基,具有多种翻译后修饰作用,且这些修饰作用被证实能够调节NF-κB的活性及生物学功能 [24]。
4.3. 通路结果分析
目前研究认为,GO富集分析靶点主要分布在细胞外空间、细胞外基质、核、核染色质、质膜外侧、细胞外等区域,分子功能有蛋白结合、酶结合,锌离子结合、蛋白同源二聚体活性、蛋白激酶活性等生物学过程。说明红花通过多途径共同作用达到抗RA效果。KEGG通路结果显示红花的抗RA靶点主要涉及通路有TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、癌症通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、T细胞受体信号通路、甲状腺激素信号通路等。PI3K-Akt信号通路中,PI3K (磷脂酰肌醇激酶)是由调节亚基p85和催化亚基p110构成二聚体。当它与生长因子受体(如EGFR)结合后,可改变Akt的蛋白结构并使其活化,并以磷酸化作用激活或抑制下游一系列底物如凋亡相关蛋白Bad、CRApRAe9活性,从而调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等表型。此外,分子对接结果发现红花的主要活性成分与关键靶点均有较好的结合作用,其中槲皮素与关键靶点的结合力最强,相互作用分析发现,槲皮素与关键靶点之间均有氢键和疏水相互作用,表明分子对接结果与Ligplot + 软件的分析结果可以相互印证,进一步验证了对接结果的可靠性。
5. 结论
综上所述,红花可能通过多途径共同作用达到抗RA效果,同时研究发现红花可能通过作用于IL-6、TNF等多个靶点,调节TNF信号通路、NF-κB信号通路、PPAR信号通路等,以抑制炎症反应,改善胰岛素抵抗等方式达到治疗RA的目的。该研究为深入探讨红花治疗RA的作用机制提供了指导。
基金项目
重庆市科技局基本科研业务费项目(cstc2020-jbky022);重庆市科技局鲁渝科技合作项目(cstc2020jscx-lyjsA0030)。