1. 引言
银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract, GBE)制剂一直作为心脑血管疾病治疗和预防的首选植物药 [1],GBE注射液(市售产品金纳多、悦康通等)在临床被广泛用于改善脑部及周围血流循环障碍,其疗效显著,受到《中国脑血管病防治指南》《国家药物处方集》等多个指南及专家共识的推荐 [2];GBE有效成分主要为黄酮类、萜内酯类(图1、图2) [3]。
GBE注射液(17.5 mg, 5 mL)在临床应用时,通常以1:10混合比例溶于生理盐水、葡萄糖输液等。溶媒加入GBE注射液或GBE注射液分散于溶媒中,药物形态及密封条件等改变可能促使药物分解、杂质超出限量等,这将大大影响注射液使用效果,也对成品配液稳定性及其使用安全性提出新考验。
Figure 1. Flavonoids from Ginkgo biloba leaves
图1. 银杏叶中的黄酮类化合物
Figure 2. Lactones from Ginkgo biloba leaves
图2. 银杏叶中的内酯类化合物
危华玲等 [4] 研究表明:在25℃条件下,GBE注射液与0.9%氯化钠注射液、5%葡萄糖注射液等5种输液配伍后6 h内基本稳定。于泽芳等 [5] [6] 研究表明:3个不同厂家的GBE注射液与0.9%氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液两种溶媒配伍后,各成品输液中的槲皮素、异鼠李素于24 h内含量基本保持不变。对GBE注射液不良反应(ADR)发生时间看出,开始给药半小时内为不良反应高峰期 [7] [8]。2020版中国药典对GBE质量控制指标是黄酮 ≥ 24%,萜内酯 ≥ 6%,银杏酸 ≤ 5 mg/kg,其余70%成分未严格控制 [9]。对于黄酮醇苷含量控制,药典以25%盐酸水解后苷元(槲皮素、山柰素、异鼠李素)总量来折算,不能准确反映GBE原料中黄酮原型成分的真实含量。刘宏等 [10] 通过对9个厂家GBE注射液指纹图谱研究发现:黄酮类、内酯类成分在各样品中均可检测到,但含量差异较大;悦康GBE注射液与金纳多注射液的水溶性成分检出较多,且两者相似度最大;其余产品的水溶性成分(糖类、烷基酚酸类、有机酸类等)检出较少或未检出。因此,一些专家学者呼吁要进一步提高GBE原料标准,并逐步对GBE原料及注射液质量进行一致性评价 [11] [12]。
综上所述,开展GBE氯化钠注射液处方优化及其质量控制研究对于提高GBE注射液质量、减少不良反应发生具有重要参考意义。本研究以银杏黄酮的指纹图谱及银杏黄酮(芦丁、水仙苷、槲皮素、山柰素、异鼠李素)、萜内酯(银杏内酯A、B、C和白果内酯)含量监控GBE原料及其氯化钠注射液质量,逐步优化处方工艺,以期实现GBE氯化钠注射液的质量控制。
2. 仪器和材料
Agilent 1260型高效液相色谱仪、HH-4数显恒温水浴锅、SHZ-95B型循环水式真空泵、PHS-3C pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)、150T多功能粉碎机(永康市铂欧五金制品有限公司)、PWN124ZH/E精密电子天平、RE52CS-1旋转蒸发仪;R1002B旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司)。
银杏叶提取物注射液(17.5 mg,5 mL;金纳多,批号HC20181022,台湾济生);银杏叶提取物注射液(17.5 mg,5 mL;悦康通,批号H20070226,中国北京);芦丁(批号:T20N11Z131674)、水仙苷(批号:S08A8D33447)、槲皮素(批号:C01J10Y91727)、山奈素(批号:G11A11L110978)、异鼠李素(批号:P14O11L124051) (上海源叶生物科技有限公司);银杏内酯A (批号:100081-200406)、银杏内酯B (批号:110863-200508)、银杏内酯C (批号:110864-200906)、白果内酯(批号:110865-200605) (中国药品生物制品检定所);甲醇(色谱级,国药集团化学试剂有限公司);微孔滤膜(孔径0.22 μm,上海兴亚净化材料厂);有机系一次性针头过滤器(尼龙,0.45/0.22 μm,津腾);水系一次性针头过滤器(聚醚砜,0.45/0.22 μm,津腾);一次性使用无菌注射器(河南曙光汇知康生物科技有限公司);95%乙醇(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);甲酸等其他常用试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)
3. 方法与结果
3.1. 银杏黄酮HPLC分析方法
3.1.1. 银杏黄酮指纹图谱分析
GBE中银杏黄酮HPLC指纹图谱分析方法 [13]:色谱柱为Eclipse Plus C18柱(150 mm × 4.6 mm, 5 μm);流动相为甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)梯度洗脱(0~15 min, 35%~40% A; 15~30 min, 40%~45% A; 30~45 min, 45%~50% A; 45~70 min, 50%~55% A);流速:0.7 mL/min;柱温:30℃;波长:360 nm。
江苏邳州及南京广润GBE粉末(标识24%黄酮,6%萜内酯) 40 mg用甲醇–水溶解定容至100 mL,过0.45 μm水系滤膜,取20 μL注入HPLC进行指纹图谱检测,如图3所示;金纳多、悦康GBE注射液,取20 μL注入HPLC进行指纹图谱检测,如图4所示。
GBE注射液一般是以银杏叶提取物为原料制成,但不同样品的银杏叶提取物的来源及质量等方面存在差异,尤其是在银杏黄酮的种类及含量方面,通过对GEB原料(江苏邳州、南京广润)以及以国外GEB原料制成的市售GBE注射液(金纳多、悦康通)进行银杏黄酮指纹图谱分析。由图3、图4可知,不同样品的黄酮种类相似,但检出色谱峰的个数和含量存在差异,其中,两种国产GEB原料间的相似度是0.803,有8个共有峰,从属一类,而市售的GBE注射液之间有高相似度,相似度是0.875,存在10个共有峰,它们从属一类。结果表明不同GEB原料银杏黄酮在成分组成上有所不同,可为后续以银杏叶提取物为原料制成的注射液提供质量监控依据。
3.1.2. 色谱分析条件
依据3.1.1所述色谱条件,取芦丁、水仙苷、槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品少许,混标20 μL注入HPLC检测;另取自制GBE氯化钠注射液(制法如3.3.1所述)、水解后的GEB注射液 [14] 20 μL注入HPLC检测,其HPLC叠加图如图5所示。
S2(5):江苏邳州GBE粉末;S1(5):南京广润GBE粉末。
Figure 3. Liquid chromatogram overlay of flavonoids in two GBE samples
图3. 两种GBE原料药银杏黄酮液相色谱叠加图
S2(8):悦康注射液;S2(8):金纳多注射液。
Figure 4. Liquid chromatogram overlay of flavonoids in two GBE injection samples
图4. 两种市售GBE注射液中银杏黄酮液相色谱叠加图
1.芦丁;2.水仙苷;3.槲皮素;4.山奈素;5.异鼠李素。
Figure 5. Liquid chromatogram overlay of standard flavonoids and GBE-NaCl injection sample
图5. 黄酮对照品与GBE氯化钠注射液样品及水解液液相色谱叠加图
由图5可知,自制GBE氯化钠注射液样品中芦丁、水仙苷、槲皮素相对含量较高,而山奈素、异鼠李素相对含量比较低,水解后的GBE氯化钠注射液主要转化为黄酮苷元槲皮素、山奈素、异鼠李素,在该色谱条件下,自制GBE氯化钠注射液样品、水解后的GEB氯化钠注射液与五种黄酮对照品均能分离完全,这适用于监控GBE氯化钠注射液中黄酮原型成分的真实含量(以芦丁、水仙苷、槲皮素进行定量分析),以及经盐酸水解的总黄酮醇苷的含量,其中,总黄酮醇苷的含量按照2020版中国药典计算:总黄酮醇苷含量 = (槲皮素含量 + 山柰素含量 + 异鼠李素含量) × 2.51。
3.1.3. 定量分析
精密称取芦丁、水仙苷、槲皮素对照品各1.0 mg、0.6 mg、0.8 mg以70%甲醇定容至10 mL,配制成含有芦丁100 μg/mL、水仙苷60 μg/mL、槲皮素80 μg/mL的储备液,分别精密取储备液0.25 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL置于10 mL容量瓶中,加70%甲醇稀释到刻度,所有样品过滤膜,分别取20 μL注入HPLC,按照上述色谱分析条件进行检测。以峰面积A (mAU*S)为纵坐标,标品浓度c (μg/mL)为横坐标做定量检测标准曲线,得三种对照品线性回归方程(见表1)。
Table 1. Linear regression equation for quantitative determination of three typical flavonoids
表1. 三种典型黄酮定量检测标准曲线
3.2. 银杏萜内酯HPLC分析方法
3.2.1. 色谱分析条件
定性检测的HPLC分析方法 [15]:色谱柱为Eclipse Plus C18柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm);流动相为甲醇(A)–水溶液(B)梯度洗脱(0~15 min, 25%~32% A; 15~20 min, 32%~32% A; 20~40 min, 32%~35% A);流速:1.0 mL/min;漂移管温度:90℃;雾化温度:60℃;柱温:30℃;进样量:10 µL。
银杏内酯A、B、C (GA、GB、GC)及白果内酯(BB)对照品用甲醇稀释,取20 μL注入HPLC进行检测;取制备得到的金纳多、自制GBE氯化钠注射液供试品溶液 [16] 20 μL注入HPLC,以GA、GB、GC、BB为参照物,其HPLC叠加图如图6所示。
1.白果内酯;2.银杏内酯C;3.银杏内酯A;4.银杏内酯B。
Figure 6. Liquid chromatogram overlay of standard terpene lactones and GBE injection sample
图6. 萜内酯对照品、金纳多及自制GBE氯化钠注射液样品液相色谱叠加图
由图6可知,自制GBE注射液样品中主要基质与四个萜内酯对照品分离良好,且该色谱分离条件可用于市售GBE注射液萜内酯的分析鉴定,并适用于后续自制GBE注射液中萜内酯的含量测定。
3.2.2. 定量分析
精密称取银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯对照品各25 mg、25 mg、50 mg、50 mg以甲醇定容至10 mL,配制成含有银杏内酯A 2.5 mg/mL、银杏内酯B 2.5 mg/mL、银杏内酯C 5.0 mg/mL、白果内酯5.0 mg/mL的储备液,分别精密取储备液0.5 mL、1 mL、2 mL、2.5 mL、5 mL置于10 mL容量瓶中,加甲醇稀释到刻度,所有样品过滤膜,分别取20 μL注入HPLC,按照上述色谱分析条件进行检测。以峰面积(mAU*S)自然对数Y为纵坐标,对照品浓度(mg/mL)自然对数X为横坐标做定量检测标准曲线,得到四种对照品线性回归方程(见表2)。
Table 2. Standard curve for quantitative analysis of terpene lactones
表2. 四种典型萜内酯定量检测标准曲线
3.3. GBE氯化钠注射液处方研究
3.3.1. 制备流程设计
参考市售产品和相关文献 [17] [18] [19],GBE氯化钠处方工艺包括GBE增溶配方、pH调节、无菌过滤、灌装及灭菌等步骤,制备流程图如图7所示。市售GBE注射液为5 mL,有效成分GBE 17.5 mg,临床使用以1:10配制输液。结合此规格和临床用法,本研究设计的GBE氯化钠注射液规格为100 mL,有效成分GBE不低于35 mg。
Figure 7. Flow chart of preparation of GBE-NaCl injection
图7. GBE氯化钠注射液制备流程图
3.3.2. 溶媒筛选
GBE中含有萜内酯等脂溶性成分,故溶媒需选用一定比例的醇水混合物 [13]。醇的比例需控制在合理范围,偏高可能会造成溶血、刺激性等不良反应,偏低则萜类内酯等脂溶性成分无法溶解。结合GBE氯化钠注射液的处方规格,溶媒选择时以100 mL溶解约40 mg GBE为宜。
本研究尝试了95%乙醇、聚乙二醇400、山梨醇、丙二醇、吐温20等多种混合溶媒及其比例,综合考虑药物溶解性、安全性等因素,当溶媒为95%乙醇:聚乙二醇400:注射用水(1:1:100)时,GBE溶解情况较好,且20℃放置1~2天后无明显沉淀或小颗粒析出,故采用此溶媒组合进行后续研究。
3.3.3. pH调节
预实验中,将市售悦康通及金纳多分别按1:10比例与0.9%氯化钠注射液混匀,测其pH分别为6.5、6.7,故尝试在5.0~7.0范围内调节pH,分别以5% NaOH溶液调节pH至5.0~5.1、5.5~5.6、6.0~6.1、6.5~6.6,考察其对GBE溶解情况、有效物质含量等影响,以GBE溶解情况、原型黄酮醇苷、总黄酮醇苷、总萜内酯含量(GA + GB + GC + BB)为指标,结果见表3。
Table 3. Effect of different pH on dissolution of GBE and content of effective substance
表3. 不同pH对GBE溶解情况、有效物质含量的影响
由表3可看出,pH值在5.0~7.0范围内对GBE的溶解情况都较好,pH值的不同对于原型黄酮醇苷有一定影响,尤其对于黄酮苷元槲皮素影响比较明显,且随着pH值的增大总萜内酯含量有所变小,但pH值对总黄酮醇苷含量影响不显著。综合考虑各项指标,最终确定pH值调节在5.0左右。
3.3.4. 过滤、杀菌的影响
按工艺处方制成GEB氯化钠注射液,pH值调节在5.0左右,为了选择适应本品的灭菌条件,以及考察处方工艺流程中经0.22 μm滤膜过滤前后对GBE氯化钠注射液有效物质含量的影响,以原型黄酮醇苷、总黄酮醇苷、总萜内酯含量为指标,结果见表4。
Table 4. Effect of filtration and sterilization on effective substance content of GBE-NaCl injection
表4. 过滤、杀菌对GBE氯化钠注射液有效物质含量的影响
由表4可看出,过滤前后对GBE氯化钠注射液中原型黄酮醇苷及总黄酮醇苷含量无明显性变化,但过滤会损失部分内酯,损耗率在5%左右,其损耗在整个处方工艺中属于正常范围内,不同灭菌条件对GBE氯化钠注射液有效物质含量无明显性变化,但从整体上来看,115℃,30 min灭菌条件下的指标要比121℃,15 min灭菌条件下的指标数值要高,且生产成本也较低。因此,在GBE氯化钠注射液的制备过程中,可忽视过滤操作中部分有效物质含量的损失,最终采用115℃灭菌30分钟的灭菌条件。
3.3.5. 处方确定
依据上述对溶媒选择与配比、pH值及灭菌条件等考察,我们确立GBE氯化钠注射液(100 mL:40 mg)的处方工艺,完整处方如表5。具体步骤如下:准确称取处方量的GBE 0.4 g,用10.0 mL 95%乙醇和10.0 mL PEG400初步搅拌溶解;分批次加入一定量60℃~70℃注射用水,持续搅拌10~15分钟;并继续加至近1000 mL,使提取物充分溶解;加入处方量的NaCl 9.0 g、NaHSO3 1.5 g,搅拌使其溶解;用稀NaOH溶液调节pH值至5.0左右,定容至1000 mL;经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌的溶液分装至100 mL注射剂瓶中,于115℃灭菌30分钟,即得GBE氯化钠注射液成品。从最终制成的GBE氯化钠注射液成品中随机选择3瓶测定其有效物质含量,考察该处方工艺是否稳定可行,由表6可看出,该3瓶GBE氯化钠注射液的有效物质含量基本无差别,初步判定该处方工艺稳定。
Table 5. GBE-NaCl injection prescription (10 bottles, 100 mL each)
表5. GBE氯化钠注射液处方(每10瓶,每瓶100 mL)
Table 6. GBE Effective substance content of GBE-NaCl injection
表6. GBE氯化钠注射液有效物质含量
4. 结论
本研究通过分析比较银杏叶提取物与市售GBE注射液(金纳多、悦康)的HPLC指纹图谱,以银杏黄酮(芦丁、水仙苷、槲皮素)、萜内酯(银杏内酯A、B、C和白果内酯)含量来监控GBE原料及其氯化钠注射液质量,所建立的方法真实可靠,能稳定反映出GBE氯化钠注射液中有效物质含量,并以此来逐步优化其处方工艺,确定处方为GBE用95%乙醇:聚乙二醇400:注射用水(1:1:100)溶解,pH调节至5.0左右,定容分装后于115℃灭菌30分钟,且注射液在有效物质含量方面有很好的稳定性。
基金项目
江苏省苏北科技专项(CZ-SZ202030)。
NOTES
*通讯作者。