1. 引言
伴随着经济的发展、生活方式的改变、人口老龄化，恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年上升，在2020年全世界新发癌症病例有1929万，中国457万(约占23.7%)全球癌症死亡病例96例，中国300万(约占30%)，肺癌是最常见肿瘤和导致死亡的主要原因之一 [1] 。“细胞衰老”(cellular senescence)一词由Hayflick团队首次提出，他们观察到正常的二倍体细胞在有限次数的分裂后停止增殖，现象类似于机体衰老，将其命名为“细胞衰老” [2] 。肿瘤细胞在多种治疗手段的干预下可诱发衰老，如拓扑异构酶抑制剂、烷化剂、铂类、抗代谢剂、微管抑制剂、激素类药物、靶向药物、免疫检查点抑制剂及PARP抑制剂、放射线等，这些药物不但诱导肿瘤细胞衰老，还能抑制肿瘤细胞的增殖，消除肿瘤细胞。益肺消瘤颗粒(原名养阴扶正方)是临床经验总结方，研究表明该药能够改善非小细胞肺癌患者的临床症状、稳定瘤灶、改善生活质量 [3] ，抑制肿瘤血管的生成 [4] ，提高机体的免疫功能及调控PD-1/PD-L1通路逆转T细胞耗竭 [5] ，对化疗药物具有减毒增效作用 [6] ，诱导肺癌细胞凋亡、抑制肺癌细胞的有氧糖酵解 [7] ，本项目在益肺消瘤颗粒有效地抑制肺癌生长的基础上，研究了益肺消瘤颗粒诱导肺癌细胞衰老的机制。
2. 材料与方法
2.1. 动物、细胞株、药物、试剂
动物：6~8周龄SPF级SD大鼠6只，购自上海杰思捷实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK(沪) 2018-0004。本实验通过《齐齐哈尔市第一医院实验动物管理办法(试行)》伦理审核，伦理编号为NO.2018-01。动物饲养于40%~60%湿度，21℃~26℃环境中，自由饮食饮水。
细胞株：人肺腺癌A549细胞由中国医学科学院肿瘤研究所提供。
药物：益肺消瘤颗粒：黄芪、党参、沙参、天冬、麦冬、生白术、山药、白花蛇舌草、拳参、绞股蓝、茯苓、莪术组成，齐齐哈尔市第一医院中草药局提供。
试剂：细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒、RIPA裂解液、Western一抗稀释液RIPA裂解液、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG (H + L)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠(碧云天生物有限公司)，0.25% Trypsin-EDTA (25200-072, Gibco)，PageRuler预染蛋白Ladder (26619, Thermo)，PCNA抗体(ab29, abcam)，PrimeScriptTM RT reagent Kit(for real time) (RR037A，TAKARA公司)，SYBR®Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus) (RR420A，TAKARA公司)，DEPC (40718，Sigma公司)，TRIzol Reagent (15596026，Ambion公司)。
2.2. 主要仪器
CO2恒温培养箱(MCO-15AC，Sanyo公司)，离心机(L-500，湘仪公司)，倒置显微镜(CKX41，Olympus公司)，HH·W21·600S电热恒温水箱(DK-S420，上海申贤恒温设备厂)，超净工作台(Baker公司)，激光共聚焦显微镜(Leica公司)，电泳仪(EPS 300，上海天能科技有限公司)、微型垂直电泳槽、垂直电泳槽(上海天能科技有限公司)，恒温孵育箱(DNP9082，精宏有限公司)，低温高速离心机(MIKRO 220 R，Hettich)，荧光定量PCR仪(LightCycler® 96，罗氏公司)，
2.3. 含益肺消瘤颗粒药物血清的制备
SD大鼠，随机分4组：益肺消瘤颗粒组低剂量组(YFXKL组、13 g/kg/d)、益肺消瘤颗粒组中剂量组(YFXLM组，26 g/kg/d)、益肺消瘤颗粒组高剂量组(YFXH组，52 g/kg/d)，正常血清组(YFXLK组，等体积生理盐水灌胃)，灌胃前禁食12小时，每日早晚2次灌胃，连续给药3天。于末次灌药1小时后，麻醉和无菌条件下腹主动脉采血，无菌分离血清(离心2000 rpm，10分钟)，同一条件下动物血清混匀，56℃，30分钟灭活抗体，0.22 um滤器除菌后分装，−80℃冰箱保存备用。
2.4. 细胞培养传代
人肺腺癌A549细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养于37℃，湿度95%，5% CO2培养箱中，每隔两天换液一次。待细胞长至80%~90%的密度进行细胞传代，用0.25%的胰酶于37℃进行消化，待细胞开始变圆后加两倍以上培养基终止消化，将细胞吹打后1000 r/min离心5 min将细胞离心后去上清，细胞用新培养基重悬后传代于培养皿中。细胞3天左右传一代。
2.5. 益肺消瘤颗粒诱导人肺腺癌A549细胞衰老作用
取对数生长期的A549细胞，以3 × 105个/孔的密度接种6孔板内，实验分为为空白(血清)对照组、益肺消瘤颗粒组，每组设3复孔。24 h后加入相应的药物血清进行处理；药物作用48 h后采用衰老相关β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测人肺腺癌A549细胞发生衰老的情况，检测流程参阅试剂盒提供的操作说明书。最终，在倒置光学显微镜下观察并计数β-半乳糖苷酶阳性染色的衰老细胞数。
2.6. 益肺消瘤颗粒对人肺腺癌A549细胞的PCNA表达的作用
取对数生长期的A549细胞，以2 × 105个/孔的密度接种于激光共聚焦显微镜配套的培养皿内，实验分为为空白(血清)对照组、益肺消瘤颗粒组，24 h后加入相应的药物血清处理，每组3个复孔；药物作用48 h后，收集细胞，用4%多聚甲醛溶液固定细胞；用0.3%TritonX-100对细胞进行破膜；加入含5%牛血清白蛋白的封闭液进行封闭处理；加入一抗兔抗人PCNA单克隆抗体，4℃孵育；加入二抗荧光Alexa Fluor® 488标记的山羊抗兔IgG进行孵育；加入DAPI进行细胞核染色，在激光共聚焦显微镜下观察荧光染色情况并扫描检测结果。
2.7. 益肺消瘤颗粒对人肺腺癌细胞的p16、p21、RB及p-RB的蛋白及mRNA表达的作用
1、Western blot法：取瘤组织匀浆，抽提组织蛋白，BCA法测定蛋白含量，加入蛋白上样缓冲液，混匀，100℃煮沸5 min，每个样分别取25 μg上样，4%~10% SDS-PAGE凝胶电泳分离，转印至PVDF膜50 g·L−1脱脂奶粉室温封闭1 h后加入相应一抗，4℃孵育过夜，PBS-T洗涤3次，每次5 min，分别加入羊抗兔或羊抗鼠二抗室温孵育2 h，PBS-T洗涤3次，每次10 min，ECL显影，以目的蛋白与内参蛋白β-actin光密度的比值表示目的蛋白的相对表达量。
2、1) 提取样本总RNA。2) 紫外吸收测定法检测浓度和纯度，RNA的纯度在1.8～2.2。3) 逆转录合cDNA. 4) 将所有cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系。体系配置如下：2 × MasterMix 10 uL，10 umol/L的PCR特异引物F0.5 μL，引物信息见表1，10 uL的PCR特异引物R0.5 uL，加水至总体积18 uL，轻弹管底将溶液混合，5000 r/min 短暂离心。5) 加样：a) 将18 uL混合液加到96-PCR板对应的每个孔中。b) 再加入对应的2 uL cDNA。c) 小心粘上Sealing Film封口膜，并短暂离心混合。d) 在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。6) 将上述96-PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。按以下程序进行：95℃，30s；40个PCR循环[95℃，5 s；60℃，40 s (收集荧光)]。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按95℃，10 s；60℃，60 s；95℃，15 s；并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/s)。7) 各样品的目的基因和内参分别进行RealtimePCR反应，每个样本检测3个复孔。数据采用2-ΔΔCT法进行分析。
3. 统计分析
采用SPSS18.0统计软件，计量数据以x ± s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，等级资料采用非参数检验。
4. 结果
4.1. 益肺消瘤颗粒诱导人肺腺癌A 549细胞衰老
Figure 1. Ratio of senescent cells of human lung adenocarcinoma A549 induced by Yifeixiaoma granules
图1. 益肺消瘤颗粒诱导人肺腺癌A549衰老细胞的比率
空白(血清)对照组益肺消瘤颗粒组
Figure 2. Morphological changes of senescent cells of human lung adenocarcinoma A549 induced by Yifeixiaoma granules (×200)
图2. 益肺消瘤颗粒诱导人肺腺癌A549衰老细胞形态学改变(×200)
图1显示，空白(血清)对照组衰老细胞的比率为5.54%，益肺消瘤颗粒组衰老细胞的比率为6.85%，两组比较有统计学差异(P < 0.05)；图2显示益肺消瘤颗粒组人肺腺癌A549显著大于空白(血清)对照组，表明益肺消瘤颗粒组人肺腺癌A549细胞存在衰老。
4.2. 益肺消瘤颗粒对人肺腺癌A549细胞的PCNA表达的作用
图3、图4显示，与空白血清组(18.7%)比较，益肺消瘤颗粒组PCNA (6.6%)的表达显著下降，有统计学差异(P < 0.001)。
Figure 3. PCNA of Yifeixiaoma granules on human lung adenocarcinoma A549 cells
图3. 益肺消瘤颗粒对人肺腺癌A549细胞的PCNA
***与空白血清组比较P < 0.001
Figure 4. Effect of Yifeixiaoma granules on PCNA expression in human lung adenocarcinoma A549 cells
图4. 益肺消瘤颗粒对人肺腺癌A549细胞PCNA表达的影响
4.3. 益肺消瘤颗粒对人肺腺癌细胞的p16、p21、RB及p-RB的蛋白及mRNA表达的作用
图5显示，与空白(血清)对照组比较，益肺消瘤颗粒组的p16、p21的蛋白表达高于空白(血清)对照组(P < 0.001)，RB、p-RB的蛋白表达低于空白(血清)对照组(P < 0.01)，有统计学差异。
图6显示，与空白(血清)对照组比较，益肺消瘤颗粒组的p16、p21的mRNA表达高于空白(血清)对照组(P < 0.001)，RB的mRNA表达低于空白(血清)对照组(P < 0.01)，有统计学差异。
***与空白血清组比较P < 0.001，*与空白血清对照组比较，P < 0.01
Figure 5. Effect of YifeiXiaoma granules on protein expression of p16, p21, RB and p-RB in human lung adenocarcinoma cells
图5. 益肺消瘤颗粒对人肺腺癌细胞的p16、p21、RB及p-RB的蛋白表达的影响
***与空白血清组比较P < 0.001，*与空白血清对照组比较，P < 0.01
Figure 6. Effect of YifeiXiaoma granules on mRNA expression of p16, p21 and RB in human lung adenocarcinoma cells
图6. 益肺消瘤颗粒对人肺腺癌细胞的p16、p21、RB的mRNA表达的影响
5. 讨论
细胞衰老以永久性的增殖停滞为特征，细胞内信号通路在DNA损伤与修复、线粒体的能量代谢异常等相关基因调控下，导致可增殖细胞不可逆地脱离细胞周期的调控，进入一种相对稳定状态。细胞衰老主要涉及p16/RB途径和p53/p21信号通路，衰老诱导治疗(therapy-induced senescence, TIS)成为治疗肿瘤的策略之一。本研究在益肺消瘤颗粒抑制肺癌细胞增殖的基础上，从PCNA、p16、p21、RB及p-RB探讨益肺消瘤颗粒诱导肺癌细胞衰老的机制，结果表明益肺消瘤颗粒可抑制PCNA的表达、上调p16、p21的蛋白及mRNA的表达，下调RB及p-RB的蛋白及mRNA的表达，是益肺消瘤颗粒诱导肺癌细胞衰老的机制。但是在肿瘤细胞中，细胞衰老的警报反应可被强制“中断”，衰老细胞可重新进入细胞周期，且获得特殊的生物活性，这些“重生”细胞往往具有多倍体 [8] 、细胞干性和高侵袭性 [9] ，经益肺消瘤颗粒诱导衰老的肺癌细胞是否能够获得“重生”有待于进一步研究，华盛顿大学研究证明：H1299肺癌细胞系可以“逃逸”喜树碱诱导后的细胞衰老并恢复增殖能力，而这种恢复能力与肿瘤细胞表达细胞分裂周期蛋白的能力之间存在正相关性，肿瘤细胞诱导衰老治疗后获得重生的机制更为复杂，因此益肺消瘤颗粒诱导肺癌细胞的机制仍需要进一步深入研究 [10] 。
基金项目
黑龙江省自然科学基金联合项目LH2020H138。