1. 背景
随着现代生活水平的不断改善,人们生活方式的转变,在过去几十年间,高脂血症已成为社会公认的心血管危害因素,高水平的胆固醇血症与动脉粥样硬化病程发展有关已成为人们的共识,多项研究表明过高的胆固醇与多种疾病的发病机制相关如肝脏疾病、糖尿病、骨质疏松症、慢性肾病、骨关节炎、阿尔兹海默症等 [1] ,蒙药童格勒格(TGLG-1)是一种单味蒙药制剂,其主要制药来源是野艾蒿,它有着降脂减肥的功效,但是目前对其具体的降脂减肥的机制及其药理学作用研究有限,还潜藏着可观的药理学价值。除了降脂作用,有药理学研究表明TGLG-1还有着抗炎抑菌的作用 [2] 。艾蒿提取物中的黄酮类、多糖、挥发油类等均表现出抗炎抑菌活性 [3] 。炎性疾病的初期大多均伴有炎症反应,通常表现为局部发红、肿胀、发热、疼痛。最常用的非甾体类抗炎药(NSAIDs)是通过抑制环氧化酶,减少炎性介质前列腺素的生成,进而发挥镇痛、抗炎、解热的作用,但在其发挥治疗效果的同时,也会产生无关于治疗目的的不良反应,例如长期使用NSAIDs会对胃肠道、肝脏、神经等系统产生损害作用 [4] [5] ,因此寻找更安全、更有效的抗炎药物具有重要的临床意义。有着2千年食用及用药史的野艾蒿,有着分布广泛,毒副作用小的天然优点。大量研究表明,野艾蒿的多种成分具有抗炎作用,因此,研究野艾蒿抗炎活性成分的作用和机制,有利于研发新的抗炎药物。本文结合课题组自主研究分析的蒙药TGLG-1成分概述了野艾蒿(蒙药名童格勒格-1)降脂抗炎国内外研究的最新进展。为此药临床应用,新药开发提供指导和借鉴。作为一种独特的文化形式中国的饮酒文化,有着悠久的历史,因为酒精饮品的多样性、不同地域饮酒存在的差异性,以及饮酒的人群不同的年龄、性别、遗传特性。酒精量化标准无法统一。但是长期大量饮酒对人身体健康造成的危害已成为不争的事实 [6] 。Pek KeiIm等人的研究指出:酒精消费每年造成全世界约300万人死亡,中国男性饮酒史与61种疾病呈正相关,其中33种疾病未被世界卫生组织定义为与酒精有关,如白内障和痛风 [7] 。目前有研究表明,酒精性骨质疏松(AOP) [8] 与酒精促进成骨分化减少,骨髓间充质干细胞(MSC)成脂分化增加有着密切的关系 [9] ,TGLG-1的降脂作用对AOP的改善有着潜在的药用价值。而对AOP药物治疗方面此药一直未得到足够的重视,因此对于童格勒格-1降脂作用的研究就显得极为必要,本文主要总结目前对蒙药童格勒格(TGLG-1)在减肥降脂方面的实验研究及临床应用,并针对其潜在药理学价值即其对酒精性骨质疏松症的治疗做出展望。
2. 童格勒格-1 (TGLG-1)简述及其化学成分分析
蒙药童格勒格-1是一种单味蒙药制剂,多年来在蒙医中应用十分广泛,临床应用上主要表现为降脂,抗炎的作用。TGLG-1的主要成分为菊科蒿属植物(野艾蒿)的茎、叶部分。以往对野艾蒿成分的研究主要集中在对其挥发性成分分析,如利用气相色谱–质谱联用技术(GC-MS)对艾蒿的主要成分进行定量分析 [10] [11] [12] [13] ,这对艾蒿的质量评估提供了可靠依据。然而迄今的研究仅仅利用挥发性成分对艾蒿进行质量评估,不能够全面反映艾蒿的内在质量,结合前期对艾蒿挥发性成分的研究,将作为艾蒿重要活性成分的非挥发成分也纳入质量评估体系内,这不仅可以完善前期对艾蒿单一的挥发性成分评估及分析方法,也为反映童格勒格-1这味药材的总体质量情况提供科研依据。
本课题组利用液质联用技术即液相色谱质谱联用技术对TGLG-1药材进行了分析,具体操作及分析如下:
一、实验材料
1. 待测样品:TGLG-1药材。
2. 主要试剂:甲醇(国药集团上海化学试剂有限公司,CAS:67-56-1);乙腈(国药集团上海化学试剂有限公司,CAS:75-05-8);甲酸(国药集团上海化学试剂有限公司,CAS:64-18-6)。
3. 主要仪器设备:超纯水仪(美国密理博公司,Milli-Q synthesis);
分析天平(瑞士METTLER公司,MS-TS);
超声仪(美国Qsonica公司,Q800R);
超高效液相色谱(waters HClass) (美国沃特世公司,ACQUITY H-Class,QDA);
高分辨质谱(美国沃特世公司,waters G2-XS Qtof)。
二、实验方法
1. 供试品溶液制备
称取TGLG-1药材粉末2 g,加入50 mL甲醇,称定重量。超声30 min,放至室温,用甲醇补足失重,摇匀,过滤,取滤液,用0.45 μm的微孔滤膜滤过,得到供试品溶液。
2. 检测条件
流动相:A:0.1%甲酸B:0.1%甲酸乙腈;
色谱柱:waters BEH C18 1.7 μm 2.1*50 mm;
柱温:40℃。
洗脱梯度如下:
3. 质谱条件
正模式:电压2 kV 负模式:电压1.5 kV;
离子源温度:110℃离子源温度:110℃;
脱溶剂温度:400℃脱溶剂温度:400℃;
氮气流速:800 L/h氮气流速:800 L/h;
采集质量数范围:50~1200采集质量数范围:50~1200;
碰撞电压:20~40 V碰撞电压:20~40 V。
三、实验结果
根据响应数值对各组分所占比例进行统计,得出各组分在药材提取液中的百分比。
1. 定性分析结果
经液相色谱正模式检测TGLG-1指纹图谱结果见图1,28 min后已无色谱峰出现,因此28 min的图谱已能反映本品的主要成分。
Figure 1. Fingerprint of TGLG-1 medicinal materials (profile recorded for 0.5 hour)
图1. TGLG-1药材指纹图谱(记录时间为0.5小时的谱图)
经液相色谱负模式检测TGLG-1指纹图谱结果见图2,28 min后已无色谱峰出现,因此28 min的图谱已能反映本品的主要成分。
Figure 2. Fingerprint of TGLG-1 medicinal materials (chromatograms recorded for 0.5 hour)
图2. TGLG-1药材指纹图谱(记录时间为0.5小时的谱图)
2. 定量分析结果
经液相色谱检测统计后TGLG-1正模式药物组分结果见表1,负模式药物组分结果见表2。正模式下含量前三为;1,3,5-三羟基-2-乙氧甲基-6-甲氧基蒽醌(38.20%)、异夏佛托苷(14.40%)、商路素(7.70%);负模式下含量前三为3,5-O-Dicaffeoylquinic acid (17.23%)、异夏佛托苷(8.52%)、Scopolin (6.13%)。
Table 1. Components of TGLG-1 liquid chromatography positive mode
表1. TGLG-1液相色谱正模式各组分组成
Table 2. Components of TGLG-1 liquid chromatography negative mode
表2. TGLG-1液相色谱负模式各组分组成
从我们的研究中可以得出TGLG-1经液质联用技术检测,正模式共90种物质,负模式共92种物质(未统计占比小于0.1%的物质),正、负两种检测模式下异夏佛托苷含量均为第二,含量前三的物质主要是黄酮类(异夏佛托苷、商陆素)、蒽醌类(1,3,5-三羟基-2-乙氧甲基-6-甲氧基蒽醌)、绿原酸(3,5-O-Dicaffeoylquinic acid)、东莨菪苷(Scopolin)。蒙药童格勒格-1在临床应用十分广泛 [14] ,其主要成分经现代药理学研究表明具有抗炎抑菌、降脂减肥、抗病毒、保肝利胆、抗肿瘤抗癌、抗过敏、降血糖、止咳平喘、止血等药理作用。结合我们实验研究结果本文将对童格勒格研究较多的抗炎、降脂作用展开综述。
3. 童格勒格-1 (TGLG-1)抗炎抑菌作用
3.1. 抗炎抑菌作用的成分
野艾蒿因其显著的抑菌作用,兼具价格低廉、分布广泛的特点,被广泛应用于医疗领域中。其发挥抑菌作用的主要成分为多糖、黄酮、及挥发油类。
3.1.1. 多糖类
在孙义玄等人的研究里艾蒿提取物中多糖因其较强的抗氧化能力,及氧自由基清除能力,通过滤纸片法测定多糖的抑菌活性及最低抑菌浓度,已被证实艾蒿多糖对革兰阳性菌抑制作用较强例如:金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌,而对革兰氏阴性菌如大肠杆菌的抑制作用较弱,此外他们还得出了艾蒿多糖的抑菌活性对温度、紫外线垂直照射有着稳定性。在酸性环境处理艾蒿多糖时抑菌活性较强,在碱性条件下多糖抑菌活性则减弱。
3.1.2. 黄酮类
作为艾蒿叶提取物中的重要化合物,艾蒿黄酮表现出优秀的抗炎抗氧化作用。李双等人在研究艾蒿提取物对酒精诱导的胃炎保护作用时发现,从艾蒿提取物分离出的黄酮类化合物可以下调 LPS 诱导的 RAW264.7巨噬细胞的促炎细胞因子水平,并在抗氧化试验中消除自由基 [15] 。体外实验也证明了艾蒿黄酮的抗炎作用。在一项验证艾蒿总黄酮体内外抗氧化应激实验中,研究人员将秀丽隐杆线虫与三种不同浓度的艾蒿总黄酮提取物共培养在过氧化氢和热刺激下,通过检测线虫体内相关抗氧化酶活力和丙二醛(MDA)的含量,发现艾蒿总黄酮提取物极显著的延长了线虫在热应激和过氧化氢氧化应激条件下的生存时间,并且极显著提高了线虫体内抗氧化产物超氧化物歧化(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力。同时实验还发现艾蒿总黄酮提取物对各种自由基(羟自由基、ABTS+自由基和DPPH自由基)的清除能力呈剂量–效应关系 [16] 。利用艾蒿提取物黄酮类成分抗炎的特性,韩国一家公司开发出了一款名为DA-9601 (stilen) ®)的药物,以艾蒿黄酮为主要成分,该药以被证明具有抗炎、胃黏膜保护的作用,现以经FDA批准上市 [17] 。
3.1.3. 挥发油类
挥发油类(AEEO)是艾蒿的另一类主要活性成分提取物,艾蒿挥发油的有效成分主要为:单萜与其衍生物、倍半萜与其衍生物、酮(醛)类、醇(酚)类、酸(酯)类、烷(烯)烃类等化学成分 [18] 在GE Y B等人的研究中发现艾蒿挥发油能显著抑制由二甲苯、冰醋酸和卡拉胶引起的小鼠炎症。与此同时研究人员通过使用不同的给药途径,观察艾蒿挥发油抗炎效果得出艾蒿挥发油皮肤渗透性优于胃肠道吸收,与经口灌胃胃肠道吸收相比AAEO通过皮肤给药生物利用度更高,能发挥更好的药理作用 [19] 。作为艾蒿提取物的重要部分近些年对艾蒿挥发油类抗炎机制的研究也在逐渐深入,在感染和炎症的急性初级反应过程中信号传导及转录激活蛋白(STAT)信号通路与酪氨酸激酶JAK是参与其基因调控的重要一环,艾蒿挥发油可通过对上游JAK2的磷酸化和STAT1信号通路下游的TYR701,STAT3中的TYR705抑制作用,在不影响JAK,STAT蛋白总水平来达到抗炎作用 [20] 。曹谨玲团队在研究艾叶挥发油对革兰阴性杆菌细胞壁成分即脂多糖诱导的巨噬细胞抗炎作用时发现,艾叶挥发油能通过抑制细胞炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP⁃1)的分泌来体现其抗炎作用LPS组RAW24.7细胞NO含量比对照组显著升高,5、10、20 μg/mL AEEO组RAW24.7细胞NO含量比LPS组均显著降低,且呈现一定的剂量效应关系 [21] 。
4. 童格勒格-1 (TGLG-1)降脂作用的机制
野艾蒿在我国有着较广泛的分布,尤其在内蒙古地区,有着丰富的资源虽然TGLG-1的临床疗效在蒙医临床上得到了患者的肯定,但其具体的降脂减肥的机制还未达成共识,目前在国内对TGLG-1减肥降脂的机制研究主要有以下3种。
4.1. 增强LDL-R的表达来达到降低血脂的作用 [22]
在周成江等人的研究中,首先制备成大鼠肝细胞株然后又制备出蒙药TGLG-1的四种粗提物,包括乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、石油醚的TGLG-1提取物。将大鼠肝细胞分成5组(一组对照组,四组实验组)。将四种粗提物按计算好的给药浓度与正常大鼠肝细胞混合培养24 h后,采用逆转录PCR法测定大鼠肝细胞低密度脂蛋白受体的mRNA表达水平。实验结果表明TGLG-1正丁醇组、乙酸乙酯组的大鼠正常肝细胞中低密度脂蛋白受体mRNA的相对含量高于对照组,经统计学分析具有显著性差异。这意味着TGLG-1正丁醇和乙酸乙酯的提取物能增强大鼠正常肝细胞低密度脂蛋白受体基因的表达,进而加快血浆中低密度脂蛋白的清除,达到调控血脂水平的药物作用。
4.2. 降低TNF-α表达来影响脂肪代谢 [23]
在与张艳杰、王登奎等人的合作科研中,通过给高血脂小鼠模型用配制好的TGLG-1水煎液灌胃,在六周后成功检测老鼠身体各脏器体积和血脂水平的变化,并密切观测肝脏的形态变化情况;又利用免疫细胞化学法来测定脂肪组织TNF-α的表达程度和脂肪细胞数量的改变情况。试验结果显示,用蒙药TGLG-1水煎液连续处理六周后,大鼠血清中的总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)水平下降,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平明显升高(P < 0.01),肝组织脂肪变性有所缓解;免疫组织化学检测的结果表明,高脂大鼠的脂肪组织中TNF-α表达要高于其它3组,而蒙药TGLG-1治疗组是表达最低的(P < 0.01)。通过已有的研究成果TNF-α可以通过促使脂类溶解,从而导致血浆游离脂肪酸(NEFA)的水平增加从而抑制胰岛素受体,具有降血浆中低胰岛素水平的效果,导致高脂血症和II型糖尿病的发生 [24] 。利用这项实验结果,张艳杰团队确定了TGLG-1不仅会影响肥胖症病人的正常血脂水平,还可以通过降低TNF-α的表达与水平,来影响脂类代谢和与肥胖症有关的各种合并症的产生、进展等,但具体的分子机理目前还未完全清楚,还有待于进一步的深入研究。
4.3. 增强肝细胞BRL株B族I型清道夫受体表达 [25]
周成江,和彦苓等通过和机制一相似的试验方法,将四种萃取物在对健康老鼠肝细菌培育二十四小时后,通过逆转录聚合酶链反射(RT-PCR)计算出健康老鼠肝细菌SR-BI mRNA的表达程度。试验结果表明,蒙药童格勒格-1 (TGLG-1)等4种提取物,均能使患者的肝细菌中SR-BI mRNA的浓度显著超过对照组。从而得出结论:蒙药童格勒格-1的提取物中有能明显增强大鼠正常肝细胞SR-BI的基因表达的成分,进而促进高密度脂蛋白–胆固醇(HDL-C)的选择性摄取,对动脉粥样硬化进程起抑制作用。
TGLG-1的原材料野艾蒿在我国有着较广泛的分布,尤其在内蒙古地区,有着丰富的资源 [26] 。结合液质联用法检测结果和文献查找我们发现TGLG-1主要成分中包含有绿原酸(CGA)、朝鲜蓟酸。最近一项研究表明CGA可能通过抑制糖酵解和脂肪酸代谢水平,降低M1型巨噬细胞促炎症细胞因子的mRNA表达,使M1型巨噬细胞炎症极化过程负调控 [27] 。这一研究也为TGLG-1降脂抗炎的药物功效提供了强有力的分子学证据。TGLG-1的其他成分还包括多种不饱和脂肪酸、亚油酸,其中以亚油酸的含量最高,而亚油酸已被证实具有预防动脉硬化、高胆固醇血症和高血脂症的作用 [28] [29] [30] 。李鹏超等人研究发现食用天然富含CLA的食物可能是控制肥胖的较好选择。且文中也强调了运动结合CLA补充减脂效果最佳 [31] 。
TGLG-1另一重要成分东莨菪苷(Scopolin)液质联用技术负模式检测含量第三的物质,有国外学者对其降脂作用及其机制进行过深入研究。在Ahyoung Yoo等人探究东莨菪苷对高脂饮食(HFD)诱导的小鼠肝脏脂肪变性是否有有益作用的实验中发现,东莨菪碱能显著缓解高脂饮食诱导下的小鼠肝脏脂肪变性,改善肝组织脂滴参数、肝脂水平、血浆AST、ALT活性及脂联素水平。Ahyoung Yoo等人在随后的机制探索实验中发现东莨菪苷发挥上述降脂功效的机制可能与SREBP1c 蛋白去乙酰化的增加和随后脂质生成基因(LXRα,ACC,LPL和FAS)的下调有关,以及 PGC-1α蛋白去乙酰化的增加和脂肪酸氧化相关基因(PPARα和CPT1)的上调有关 [32] 。
5. TGLG-1治疗酒精性骨质疏松(AOP)的潜在药理学价值
长期大量饮酒和与酒精有关的疾病会对心脏,大脑,肝脏,肌肉和骨骼等多个器官产生各种有害影响 [26] 而且有研究表明长期大量酗酒与骨骼重塑受损和骨折风险增加正相关 [33] 。酒精性骨质疏松在国际上被界定为一类渐进性的全身性骨质病变,其主要特点体现为骨质形成与骨吸收之间的失衡。与非酒精性骨质疏松患者相比AOP患者骨折风险和骨折延迟愈合风险更大 [34] 。受气候、历史、人文等因素的影响,在北方高寒地带如内蒙地区,喝酒群体的规模较大,喝酒时间比较频繁、单次酒精饮品用量高、酒精度数较高、且多以酒精度数高的白酒为主的特点,这些因素将极大地增加当地人民罹患AOP的风险。而一旦AOP患者发生骨折就会导致较高的致死致残率,这将给患者家庭及国家社会带来沉重的负担 [9] 。AOP的产生、发展过程与骨骼代谢的相关激素、营养、遗传、生存环境等诸多因素相关,但目前对其更详细的发病机制尚不明确,多种机制参与其中,有待进一步研究。现代医学研究表明人体摄入的酒精主要通过改变MSCs、成骨细胞、破骨细胞等的增殖、分化,进而引起骨组织形成减少的同时,脂肪组织不断增多,肠道微环境改变等一系列病理生理变化,最终形成骨质疏松 [10] [35] [36] 。针对AOP的治疗戒酒是首要治疗方案,但是有些酒精依赖患者难以戒断,仍需药物辅助治疗以延缓疾病进展。防治AOP的药物目前有促进骨骼钙化药、骨吸收抑制剂,中药等,但在服药期间应避免过度饮酒,保持良好的生活习惯 [37] 。近年来抗骨硬化蛋白(sclerostin)药物,组织蛋白酶K抑制剂、植物提取物异黄酮类物质等新药也受到研究重视 [2] [7] [38] 。根据现有的研究表明蒙药TGLG-1在治疗及延缓AOP病程方面有着良好的前景。其包含的有效成分通过对脂肪代谢进行调节来发挥降脂抗炎的作用,而上文提及的AOP进展过程中会促进BMMSCs的成脂向分化并上调炎性因子的表达,那么如果发挥TGLG-1的降脂抗炎作用进行对AOP的针对治疗,是否可以改善AOP疾病发展进程,鉴于目前对TGLG-1的研究仍停留在有效成分提取与分离、药理学作用研究等方面,随着现代科学技术的不断发展进步,建议在今后可采用网络药理学、分子生物学等多种研究方法展开对TGLG-1降脂抗炎作用及治疗AOP的潜在药理学价值的深入研究,明确药物核心药效成分的组成,为研发治疗AOP的更为有效的新药物奠定基础。
6. 小结与展望
作为蒙古族人民制作单味蒙药TGLG的原材料,野艾蒿具有分布广泛,资源量巨大的特点,自古就有药食同源 [39] 的优势,我们为明确其化学成分及生物学活性,采用液质联用的技术对其成分进行了分析,并通过查找国内外文献的方式总结了目前对野艾蒿研究较多的抗炎、降脂的生物学作用。野艾蒿发挥抗炎作用的主要成分包括多糖、黄酮、挥发油类物质。其中艾蒿多糖对格兰阳性菌抑制作用较强,利用艾蒿黄酮抗炎的特性已经开发出经FDA批准的新药;艾蒿挥发油类中发挥抗炎作用的主要为萜类化合物,通过不同给药方式发挥不同强度的抗炎作用,目前研究显示对上述三类物质抗炎的机制还在不断探索验证。此外蒙药童格勒格(TGLG-1)的减肥降脂疗效显著,在蒙医临床已经应用多年,大多数有降脂作用的天然中草药主要是因为其包含不饱和脂肪酸和黄酮类物质,通过这些成分来达到调节血脂,改善动脉粥样硬化水平的 [40] ,前一阶段的研究已证实TGLG-1降脂的有效成分包括绿原酸(CGA)、朝鲜蓟酸,其他成分如不饱和脂肪酸、亚油酸也有一定的降脂功效。近些年的动物实验研究表明TGLG-1的乙酸乙酯粗提物中是降脂效果最明显的,而且在国内的研究中其降脂作用的机制主要是通过1) 增强LDL-R的表达从而降低血脂;2) 降低TNF-α的表达来影响脂肪代谢;3) 增强肝细胞BRL株B族I型清道夫受体表达进而促进高密度脂蛋白–胆固醇(HDL-C)的选择性摄取,对动脉粥样硬化病程进展起抑制性作用。因为未予以TGLG-1足够的重视,对其研究还十分欠缺。TGLG-1的药理学及分子生物学研究亟待开展。AOP在疾病进展过程中会促进BMMSCs成脂向分化并上调炎性因子表达,1965年有学者首先发现过度饮酒者尸体标本中非脂肪骨量明显降低 [41] 。那么,如果发挥TGLG-1降脂和抗炎的作用进行AOP的针对性治疗,是否可以改善AOP病程,延缓其病情发展?目前利用TGLG-1治疗AOP尚未见文献报道。TGLG-1此方面的潜在药理学价值有待进一步发掘。
基金项目
1) 内蒙古科技厅科技计划项目(2021GG0174);2) 内蒙古自治区科技计划项目(2022YFSH0022);3)内蒙古科技厅计划项目(2020GG0195);4) 内蒙古自治区自然科学基金项目(2019MS08158);5) 内蒙古科技厅科技计划项目(2022YFSH0020);6) 内蒙古自治区高等学校科学研究项目(NJZZ22665)。
NOTES
*通讯作者。