1. 引言
DNA浓度测量在基因组学研究中至关重要。因为它提供了关于DNA样品纯度和浓度的关键信息。随着科技的不断发展，我们目睹了多种先进技术的涌现。毛细管电泳 [1] 通过高分辨率的分离为我们提供了更为准确的浓度信息，而纳米孔测序技术则在实时监测DNA浓度方面取得了显著的突破。微流控芯片技术 [2] 的崛起使得在微小尺度上进行高通量的DNA测量成为可能，同时，结合人工智能和机器学习 [3] 的应用，研究人员能够更加智能地解析和利用庞大的测量数据 [4] 。这些创新性的技术不仅提高了测定的精度和敏感性，也为科学家们在基因组学、医学研究以及生命科学领域的各个方面提供了更全面的工具，推动着我们对生命基因的深入理解。传统实验室DNA浓度测量主要依赖紫外吸光度法 [5] ，使用紫外分光光度计测量DNA在260/280 nm处的吸光度。然而，这方法通常需要较多生物样品，并且对于提取的DNA样品较少的情况，传统的紫外分光光度计可能无法有效测量。
为了提高测量的灵敏度和减少所需样品量，Thermo Fisher Scientific公司基于吸光度法推出了Nanodrop 2000，通过改进光路结构实现了微量检测。然而，吸光度法的主要局限在于对DNA纯度 [6] 的要求较高，混入其他物质如RNA可能导致测量偏差。除了传统的吸光度法和荧光光谱法 [7] 之外，近年来的研究进展主要集中在提高测量精度、灵敏度，并减少所需样品量以及降低成本等方面。荧光光谱法作为一种新的DNA浓度测量方法逐渐在市场上得到应用。荧光光谱法利用DNA与荧光染料结合后在特定波长下产生荧光 [8] 的原理，通过检测荧光强度与DNA浓度的关系来进行测量。相比吸光度法，荧光光谱法 [9] 具有更高的灵敏度和特异性，能够有效解决混入杂质导致测量不准确的问题。美国国家标准与技术研究所使用Pico Green荧光染料对植物DNA进行染色，比较了紫外吸收和荧光光谱两种方法的相关性，结果显示荧光测量方法具有更高的可靠性。
尽管荧光光谱法在提高灵敏度和特异性方面具有优势，但市场上的荧光光谱仪通常体积较大，而且耗材成本较高。为解决这一问题，本文基于荧光光谱法搭建了核酸浓度测量微型光路系统，并开发了相应的算法，建立了DNA浓度和荧光强度之间的数学模型。这一创新为生物分子领域提供了低成本、快速、高效的DNA浓度测量方法。
2. 微型浓度检测系统的搭建
所构建的DNA浓度微型测量系统(图1)由一个中心波长505 nm的激光模组作为光源、荧光光谱检测仪、样品位移台组成。SYBRGreenI与DNA组成的混合物溶液 [10] ，在该光源照射下，会产生中心波长为520 nm的荧光，该荧光信号被微型光谱仪采集 [11] ，并记录不同浓度DNA对应的荧光强度通过测量荧光强度随被测DNA浓度 [12] 之间的变化关系。为避免收集的荧光信号受入射光干扰，采用了正交光路收集荧光。
Figure 1. Schematic diagram of DNA concentration detection system
图1. DNA浓度检测系统原理图
3. 实验部分
10,000 × SYBR Green I高浓缩荧光染料(上海瑞楚生物科技公司)；100 bp DNA Ladder (120 ng/μL)和5 × Trisborate-EDTA (TBE) (北京索莱宝生物科技公司)；超纯水；TBE储备液(0.5×)：将5 × TBE原液和超纯水按1:9比例稀释，常温保存；SYBR Green I储备液(100×)：将10,000 × SYBR Green I和超纯水按1:99比例稀释，避光低温保存。
4. 结果和讨论
4.1. DNA荧光强度与其浓度之间的变化关系
Figure 2. Fluorescence spectra of DNA and fluorescent dye mixtures in the range of 515~550 nm
图2. DNA与荧光染料混合物在515~550 nm范围内的荧光光谱
SYBR Green I作为一种广泛用于核酸染色的荧光染料 [13] [14] ，与DNA结合后，使用505 nm的激光对DNALadder的混合物进行照射后会产生荧光。为此，以0.5 × TBE为背景液，配制了1~17 ng/μL范围内的DNA样品，采用SYBRGreenI的浓度为25×，在构建的系统中获得了其荧光光谱(图2)。可以发现，荧光信号的峰值波长位于522 nm附近，且随着DNALadder的浓度增加，其荧光强度也随DNA浓度增加呈正相关关系，这为通过荧光强度值测量DNA浓度建立了实验基础。
4.2. 荧光强度随荧光染料浓度的变化关系
SYBR Green I是一种内嵌染料，该染料结合于双链DNA双螺旋小沟区域。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。然而，被测样品中所含荧光染料过多，也可能会导致荧光信号减弱，为此，以24 ng/μLDNA作为样品，分别添加1×、5×、10×、15×、20×、25×、30×和35×等八种不同浓度的SYBR Green I试剂，研究了DNA荧光强度随荧光染料的变化关系。结果表明，当荧光染料由1×增加至25×时，荧光强度随染料浓度增加而升高；当荧光染料浓度高于25×时，荧光强度急剧减少(图3)。为此，采用25 × SYBR Green I荧光染料测量DNA浓度。
Figure 3. Effect of 1~35 ng/μL SYBR Green I on fluorescence spectra
图3. 添加1~35 ng/μL不同浓度的SYBR Green I对荧光光谱的影响
4.3. DNA浓度与其荧光强度之间的量化关系
Figure 4. The relationship between different concentrations of DNA Ladder and fluorescence intensity
图4. 不同浓度的DNA Ladder与荧光强度之间的线性关系
基于以上数据，采用25 × SYBR Green I作为荧光染料，采用了1~14 ng/μL范围内DNA样品的荧光光谱，并记录其522 nm处荧光强度，每组实验重复5次，并利用最小乘值法对所绘数据进行曲线拟合，绘制了DNA浓度与其荧光强度的关系(图4)，结果表明，二者之间具有较高的线性关系，相关系数为0.99。
进一步，将特定浓度的DNA样品做与25 × SYBR Green I，0.5 × TBE背景液按一定比例混合，配制成1~16 ng/μL的检测液，在构建的光学系统中测量522 nm处荧光强度值(表1)，并依据所构建的荧光强度与浓度之间的量化关系计算其浓度值。结果表明，在10~100 ng/μL浓度范围内，系统能在很小的误差内精确的预估出DNA的浓度数值。
Table 1. Fluorescence intensity and concentration measurements of DNA samples with different concentrations
表1. 不同浓度DNA样品荧光强度值与浓度测量值
5. 结论
本文基于荧光光谱法，构建微型核酸浓度测量系统，通过优化SYBR Green I荧光染料浓度，建立了DNA荧光强度与其浓度之间的量化关系。结果表明，在1~16 ng/μL范围内，DNA浓度与其荧光强度呈线性关系，相关系数高达0.994。对于10~100 ng/μL范围内的DNA样品，浓度测量相对偏差小于5%。从而为微型DNA浓度测量系统的开发提供了坚实的实验基础。
NOTES
*通讯作者。