摘要: 目的：通过检测强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)患者外周血单个核细胞(单核细胞、淋巴细胞)表面TLR2 (Toll-like receptors2, TLR2)、TLR4 (Toll-like receptors4, TLR4)的表达及淋巴细胞凋亡的数量，探讨TLR2、TLR4及淋巴细胞的凋亡与强直性脊柱炎发生发展的关系。方法：应用流式细胞术检测67例AS患者(非活动性组39例，活动性组28例)和30例健康体检者的外周血标本。通过应用FITC-TLR2、PE-TLR4两种试剂检测外周血单个核细胞表面TLR2、TLR4的表达水平,以及流式Annexin-v FITC/PI法检测外周血淋巴细胞的凋亡量。各实验检测均设定相应的同型或阴性对照。结果：1) AS患者外周血单个核细胞表面TLR2在疾病组、活动性组和非活动性组分别为：23.16%、23.07%和23.22%，均高于健康对照组12.53%，差异有统计学意义(P < 0.01)；AS非活动性组与活动性组比较差异无统计学意义(P > 0.05)。2) AS患者外周血单个核细胞表面TLR4在疾病组、活动性组和非活动性组分别为：24.43%、24.51%和24.38%，均高于健康对照组12.55%，差异有统计学意义(P < 0.01)；AS非活动性组与活动性组比较差异无统计学意义(P > 0.05)。3) AS患者外周血淋巴细胞凋亡在疾病组、活动性组、非活动性组分别为： 84.00%、79.64%和87.14%，均低于健康对照组98.26%，差异有统计学意义(P < 0.01)；AS活动性组低于非活动性组，差异有统计学意义(P < 0.01)。4) AS患者外周血单个核细胞表面TLR2、TLR4与AS活动性(BASDI)无相关性(r = 0.043及0.112，P > 0.05)；AS患者外周血淋巴细胞凋亡与活动性呈中度负相关(r = −0.568, P < 0.05)。结论：1) AS患者外周血单个核细胞表面TLR2、TLR4出现异常增高。2) AS患者外周血淋巴细胞凋亡量减少。
Abstract:
Objective: By detecting the expression of TLR2 (TLR2) and TLR4 (TLR4) on the surface of peripheral blood mononuclear cells (mononuclear cells and lymphocytes) and the number of lymphocyte apoptosis in patients with ankylosing spondylitis (AS), the relationship between the apoptosis of TLR2, TLR4 and lymphocyte and the occurrence and development of ankylosing spondylitis was discussed. Methods: Peripheral blood samples of 67 AS patients (39 in the inactive group and 28 in the active group) and 30 healthy subjects were detected by flow cytometry. Expression levels of TLR2 and TLR4 on the surface of peripheral blood mononuclear cells were detected by fitc-tlr2 and pe-tlr4 reagents, and apoptosis of peripheral blood lymphocytes was measured by flow annexin-v FITC/PI method. Corresponding homotypic or negative controls were set for each test. Results: 1) TLR2 on the surface of peripheral blood mononuclear cells in patients with AS was 23.16% in the disease group, 23.07% in the active group and 23.22% in the inactive group, respectively, higher than 12.53% in the healthy control group, and the difference was statistically significant (P < 0.01). There was no statistically significant difference between the inactive AS group and the active AS group (P > 0.05). 2) TLR4 on the surface of peripheral blood mononuclear cells in patients with AS was 24.43%, 24.51% and 24.38% respectively in the disease group, the active group and the inactive group, all higher than 12.55% in the healthy control group, and the difference was statistically significant (P < 0.01). There was no statistically significant difference between the inactive AS group and the active AS group (P > 0.05). 3) The apoptosis of peripheral blood lymphocytes in patients with AS was 84.00% in the disease group, 79.64% in the active group and 87.14% in the inactive group, respectively, which was lower than that in the healthy control group (98.26%), and the difference was statistically significant (P < 0.01). AS activity group was lower than the inactive group, and the difference was statistically significant (P < 0.01). 4) TLR2 and TLR4 on the surface of mononuclear cells in peripheral blood of AS patients were not correlated with AS activity (BASDI) (r = 0.043 and 0.112, P > 0.05). Peripheral blood lymphocyte apoptosis was negatively correlated with activity in patients with AS (r = −0.568, P < 0.05). Conclusion: 1) Abnormal increase of TLR2 and TLR4 were appeared on the surface of mononuclear cells in peripheral blood of AS patients. 2) Apoptosis of lymphocytes in peripheral blood of AS patients decreased.
1. 引言
强直性脊柱炎是仅次于类风湿性关节炎的一种常见的全身性自身免疫性疾病，主要侵犯中轴关节，以骶髂关节炎和脊柱强直为其主要特点，病因与发病机制迄今未明 [1] 。AS在全球各国发病率存在明显种族、地区差异 [2] ，贵州地区为此病多发区域，可能与贵州属于高海拔地区及较为湿寒的环境气候有关 [3] 。该病多发于15~30岁的男性青壮年，病情严重患者极易致畸致残并丧失生活自理能力 [4] 。AS发病机制目前不清，近年来提出多种假说，如病毒感染假说、遗传假说、免疫假说 [5] 。有研究结果显示 [6] ，自身免疫、细菌感染等都是AS发病的重要因素，因此目前有很多学者将强直性脊柱炎化归为自身免疫性疾病。
TOLL样受体(Toll-like receptors, TLR)信号是机体抵抗外界感染的第一道防线，但信号的过度活化也可引起级联反应，打破机体对自身抗原的免疫耐受，促进自身免疫性疾病的发生发展 [7] 。文献报道 [8] ，TLR不仅参与抗菌免疫还参与某种自身免疫病(如SLE、RA)的发生。TLR是识别微生物成分的特定模式分子，它的发现使人们认识到天然免疫和适应性免疫一样重要，它们共同防御入侵的病原体，并能通过信号转导将二者有效连接起来 [9] 。TLR亚型中TLR2 (Toll-like receptors2, TLR2)和TLR4 (Toll-like receptors4, TLR4)是主要参与天然免疫的两种亚型。
细胞增殖和凋亡的动态平衡是维持机体自身免疫稳定的重要因素，这种平衡的破坏可能会导致多种自身免疫性疾病的发生。文献报道，TLR与中性粒细胞的凋亡密切相关 [10] ，在TLR亚型中TLR2具有诱导凋亡和抗凋亡的作用，TLR2与淋巴细胞凋亡的改变在AS疾病的发生发展过程中是否存在相关性并未见报道。因此，本课题通过研究强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞表面TLR2、TLR4与淋巴细胞凋亡的数量，为探讨强直性脊柱炎患者疾病的发生、发展及病程监测提供新思路和新途径，以期为临床诊断及治疗提供新思路新方法。
2. 材料与方法
2.1. 材料
标本来源：收集2017年6月至2017年11月贵州医科大学附属医院及贵阳中医学院第一附属医院HLA-B27阳性的强直性脊柱炎患者外周血标本67例，入选标准采用的是1984年修订的纽约标准 [11] 。具体标准包括两项：1) 临床标准：a) 腰痛，晨僵3个月以上，活动改善，休息无改善；b) 腰椎额状面，矢状面活动受限；c) 胸廓活动度低于相应年龄、性别的正常人。2) 放射学标准：a) 骶髂关节炎，双侧 > II级或单侧III~IV级。II级为轻度异常，可见局限性侵蚀，硬化，但关节间隙正常。III级为明显异常，有侵蚀，硬化，关节间隙增宽或狭窄，部分强直等1项(或以上)改变。IV级为严重异常，即完全性关节强直。其中男性53例，女性14例，年龄9~58岁，平均年龄28岁，男性平均年龄27岁，女性平均年龄30岁。健康对照组30例，外周血标本均来自贵阳中医学院第一附属医院体检中心健康体检者，其中男性24例，女性6例，年龄19~52岁，平均年龄27岁，无HIV感染,无病毒性肝炎，无自身免疫性疾病史，血压、心肺功能、血常规、血生化、肝功能、肾功能、尿检均正常。
2.2. 方法
1) 标本收集：实验对象标本采集晨起空腹静脉血2 ml至EDTA-2K抗凝管中，标本于采集后6小时内行流式细胞术检测。
2) 标本检测：调整FACSCanto II至最佳工作状态：打开流式细胞仪运行开机程序，待仪器预热后使用校准品7色标准荧光校准微球(BD FACS 7-Color Setup Beads)在FACS Canto软件下校正光路和电路，调节仪器电压使微球在预订靶值，检测仪器灵敏度，校准成功后在运行上机程序。标本检测：打开FACS Diva软件，将标本置于上样盘中依次收集标本，同时设空白、同型对照，每管收集1 × 104个细胞，检测TLR2、TLR4及淋巴细胞凋亡。
2.3. 统计学分析
采用SPSS19.0分析实验数据：计量资料的统计描述用均数±标准差(
)表示，统计分析采用方差分析，组间差异分析有统计学意义者再采用最小显著差法(LSD法)进行多重比较分析，以P < 0.05作为具有统计学差异的界值。在符合正态分布的两变量之间相关性分析采用Pearson相关分析方法方法进行统计分析；不符合正态分布的两变量之间相关性分析采用Spearman相关分析
方法进行统计分析，|r| > 0.7存在高度相关，0.4 ≤ |r| < 0.7中度相关，|r| < 0.4低度相关，以P < 0.05作为具有统计学差异的界值。
3. 结果
1) 不同活动性AS患者单个核细胞TLR2的检测结果
AS患者外周血单个核细胞TLR2，AS疾病组(23.16 ± 1.13)%与健康对照组(12.53 ± 0.77)%比较增多，差异有统计学意义(P < 0.01)；且AS非活动性组(23.22 ± 1.12)%、活动性组(23.07 ± 1.16)%与健康对照组比较均也增多(P < 0.01)，差异有统计学意义；AS非活动性组与AS活动性组比较，差异无统计学意义(P > 0.05) (表1，图1)。
Table 1. The expression levels of TLR2 in PBMC of AS patients and healthy control (%)
表1. AS患者及健康对照外周血单个核细胞TLR2的表达水平(%)
注：与健康对照组比较*P < 0.01。
注：(a) 健康对照组；(b) 非活动性组；(c) 活动性组
Figure 1. The flow chart of TLR2 (%)
图1. TLR2流式细胞图(%)
2) 不同活动性AS患者单个核细胞TLR4的检测结果
AS患者外周血单个核细胞TLR4，AS疾病组(24.43 ± 0.80)%与健康对照组(12.55 ± 0.81)%比较增多，差异有统计学意义(P < 0.01)；且AS非活动性组(24.38 ± 0.84)%、活动性组(24.51 ± 0.75)%与健康对照组比较均也增多(P < 0.01)，差异有统计学意义； AS非活动性组与AS活动性组比较，差异无统计学意义(P > 0.05) (表2，图2)。
Table 2. The expression levels of TLR4 in PBMC of AS patients and healthy control (%)
表2. AS患者及健康对照外周血单个核细胞TLR4的表达水平(%)
注：与健康对照组比较*P < 0.01。
注：(a) 健康对照组；(b)非活动性组；(c) 活动性组
Figure 2. The flow chart of TLR4 (%)
图2. TLR4流式细胞图(%)
3) 不同活动性AS患者外周血淋巴细胞凋亡的检测结果
AS患者外周血淋巴细胞凋亡，AS疾病组(84.00 ± 5.08)%与健康对照组(98.26 ± 0.70)%比较减少，差异有统计学意义(P < 0.01)；且AS非活动性组(87.14 ± 3.23)%、活动性组(79.64 ± 3.79)%与健康对照组比较均也减少，差异有统计学意义(P < 0.01)；AS非活动性组与AS活动性组比较，差异有统计学意义(P < 0.01) (表3，图3)。
Table 3. The comparison of apoptosis in PB lymphocyte of AS patients and healthy control
表3. AS患者及健康对照外周血淋巴细胞凋亡(%)
注：与健康对照组比较*P < 0.01，与非活动性组比较#P < 0.01。
注：(a) 健康对照组；(b) 非活动性组；(c) 活动性组
Figure 3. The flow chart of lymphocyte apoptosis
图3. 淋巴细胞凋亡流式细胞图(%)
4) AS患者TLR2、TLR4、淋巴细胞凋亡与活动性的相关性分析
AS患者外周血单个核细胞表面TLR2与活动性(BASDI)无相关性(r = 0.043，P > 0.05)；AS患者外周血单个核细胞表面TLR4与活动性无相关性(r = 0.112，P > 0.05)；AS患者外周血淋巴细胞凋亡与活动性呈中度负相关(r = −0.568, P < 0.05) (见表4)。
Table 4. Correlation between TLR2, TLR4, apoptosis with activity in AS patients
表4. AS患者TLR2、TLR4、淋巴细胞凋亡与活动性的相关性分析
4. 讨论
强直性脊柱炎是一种与HLA-B27相关的慢性炎性风湿性疾病，以中轴关节慢性炎症为主，并几乎累及骶髂关节，被认为与遗传、环境、感染相关 [12] [13] 。在脊柱关节病模型的病因研究中，细菌感染与HLA-B27之间的作用可能是一个关键因素，AS与HLA-B27抗原呈强相关性，HLA-B27是迄今已知的与AS疾病关联最强的检测指标。本研究检测样本皆选自HLA-B27阳性的标本。
有研究报道，固有免疫应答和获得性免疫应答在强直性脊柱炎的发病中均起作用 [14] 。TOLL样受体(toll-likereceptors,TLRs)是近年来备受关注的一种模式识别受体，作为天然免疫分子的成员已经成为目前免疫学研究的热点。目前在人体中发现了10种TLR的亚型 [15] ，TLR分布广泛，主要表达于免疫细胞如树突状细胞、淋巴细胞、单核巨噬细胞 [16] 。大量研究表明TLRs通过识别不同病原体的病原相关模式分子(pathogen associated molecular pattern，PAMP) [17] ，在机体的天然免疫和获得性免疫中发挥着重要作用。有研究报道，TLR2和TLR4在TLRs中表达范围最广，是介导天然免疫反应及适应性免疫应答的重要分子 [18] ，通过刺激T细胞的活化与增殖，引起适应性免疫应答，在RA等自身免疫性疾病的发病中发挥重要作用 [19] 。在TLR家族中TLR2和TLR4表达在细胞表面，既是连接天然免疫和获得性免疫的关键分子，又是主要的病原菌识别受体，TLR2主要识别革兰阳性细菌的脂蛋白与肽聚糖，TLR4主要识别革兰阴性细菌的脂多糖(LPS)。人们一直怀疑感染因素在AS等自身免疫性疾病的病因和发病机制中可能有重要作用，TLR2和TLR4的高表达可能与其接受感染因子刺激有关。苏虹等 [20] 曾报道在AS疾病发展过程中，可能存在病原微生物感染或内源性物质经TLR4通路造成炎症损失继而引发AS，TLR通过信号转导通路可以激活多种促炎性因子进而参与抗感染的炎症过程。AS是自身免疫性疾病，存在活化的针对自身抗原的免疫反应，TLR2、TLR4能够通过刺激类风湿关节炎小鼠模型中T细胞的平衡状态而引起免疫紊乱，随着动物模型及免疫学、分子生物学研究进展，发现AS与CD4 + T淋巴细胞免疫异常有关 [21] 。近年来大量研究表明T细胞凋亡不足和增殖增加与某些免疫性疾病的发生有关 [22] 。细胞凋亡不仅参与了免疫系统中免疫细胞的生长发育、免疫调节、免疫效应等生理机能，而且在维持免疫功能稳定方面也具有重要作用 [23] 。
5. 结论
本研究结果显示，AS患者外周血单个核细胞表面TLR2、TLR4均较健康人增多，这与De Rycke等人 [24] 和Yang等人 [25] 及毋静 [26] 等人的研究结果相一致。且AS患者在活动性组与非活动性组中TLR2、TLR4的表达均高于健康对照组，但活动性组与非活动性组之间的表达无统计学意义。提示在AS患者体内TLR2、TLR4表达水平于疾病非活动期即可出现异常，并且异常表达水平伴随AS疾病的整个发病过程，虽然在疾病发展过程中并没有随疾病的进展而增加，但在AS患者体内，无论疾病处于何阶段，TLR2、TLR4皆较健康对照增高。本研究结果及前期研究结果为TLR2、TLR4通过介导T淋巴细胞的免疫表达继而激活促炎因子，可能为炎症感染参与的自身免疫性疾病的发生提供依据，并且提示AS疾病的发生与感染因素相关。纠正细胞失衡、调节其功能、防治治炎细菌的感染是治疗AS的可能策略，以达到诱导病情缓解、减轻关节炎症反应。
本研究结果还指出，AS患者外周血淋巴细胞凋亡数量较健康对照组低，从侧面反映AS患者体内淋巴细胞凋亡缓慢，提示AS与淋巴细胞的凋亡有着一定的关系，与王海隆等的研究结果一致 [27] 。并且AS患者活动性组与非活动性组淋巴细胞凋亡的数量也存在统计学的差异，提示在疾病发展过程中淋巴细胞凋亡数量持续异常表达，随着疾病的发生发展持续性出现，正常的组织代谢受到严重影响。淋巴细胞凋亡数量随着疾病活动性的增加逐渐减少，相应的淋巴细胞出现了相对性增多，导致了AS患者体内自身免疫功能紊乱，使免疫应答也发生异常的表达。
综上所述，AS患者单个核细胞表面TLR2、TLR4与淋巴细胞凋亡数量在AS疾病的发生发展过程中均呈现某种相应的异常改变。在非活动期，单个核细胞表面TLR2、TLR4检测可用于AS的鉴别诊断，对于疾病的发现与治疗颇有意义。