1. 引言
全球转基因作物种植面积迅猛增长，2017年突破1.898亿hm2，连续21年增长。目前大多数植物的转基因方法主要是经典的农杆菌和基因枪法 [1]。两者均使用愈伤组织为受体，需要经过繁琐冗长的组培过程，有可能会产生体细胞变异，并且具有基因型依赖性 [2]。基因枪转化尽管不受寄主限制但容易造成伤害和引发突变，农杆菌则具有天然转化机理，形成单拷贝转化体 [3] [4]。为了获得高的转化率，研究者不断尝试对不同的组织和器官进行转化，如使用茎尖、顶端分生组织和种子 [5] [6]。目前，在玉米、水稻 [7] 、小麦 [8] 等重要禾谷类作物上多种农杆菌转化方法已经建立起来。另外，农杆菌转化愈伤组织的时候，各种物理的辅助措施(如离心、真空抽滤、超声和热击等处理 [9] )被认为可以增加农杆菌的侵染以提高转化率，有研究对于成熟组织的花粉和萌动种子这类受体，也采用了这些辅助方法 [10] [11] [12] [13]。本研究采用金刚砂辅助农杆菌进行萌动种子胚处理方法，将EPSPS基因 [14] 导入花生仲恺花01和12号，以期获得转基因抗草甘磷花生。因为花生种子的种皮比较坚硬不易被基因枪穿入，而且基因枪的射入方向单一直接，转化效果不佳。如果我们在穿刺种皮的基础上，用金刚砂代替基因枪的子弹用超声的方法处理种子，金刚砂就会随超声波以自由散射的方式射入花生种子胚，以便农杆菌随之进入胚内进行基因转化。本实验在方法上进行了创新。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
2.1.1. 种子
仲恺花01号和仲恺花12号花生种子(由仲恺农业工程学院农学院提供)。仲恺花01号和12号均为珍珠豆型花生品种，丰产性好，含油率较高；中抗青枯病，田间表现高抗锈病、中抗叶斑病；耐旱性、抗倒性和耐涝性均较强，适宜广东省各地水旱轮作田春、秋季种植。
2.1.2. 根瘤农杆菌
CP4菌株：如图1，带有Ti重组质粒的LBA4404农杆菌，Ti重组质粒中有EPSPS基因(标记基因为利福平抗性基因和卡那霉素抗性基因)。
2.1.3. 除草剂
除草剂为草甘膦(glyphosate)。
2.2. 实验方法
2.2.1. 准备花生种子
取仲恺花01号和12号，剥壳后每瓶约60颗，分装在广口瓶中，27℃恒温浸泡4小时。
2.2.2. 穿刺处理萌动种胚
采用0.25 mm长针灸针，将5根捆成一束，在花生的根部下端1.5 mm，用短针斜角45度插入2 mm，最多刺2次，在进行操作的过程中需要注意深度，以防损伤过度导致花生胚死亡(如图2)。
2.2.3. 金刚砂和超声波处理穿刺的萌动种胚
将针刺处理过的花生种子放入烧杯，加入少量金刚砂，加水没过，置于超声波仪进行超声波处理(如图3，工作效率800 W，工作10 s，休息3 s，循环3次)。
Figure 3. Treatment of germinating seeds by emery and ultrasonic wave
图3. 金刚砂和超声波处理萌动种胚
2.2.4. 农杆菌共培养
将烧杯中的水倒掉，洗净沾在花生上的金刚砂，转入广口瓶，加入已培养好的菌液，液面稍微高于花生(菌液取已完成活化的CP4菌株加入新的LB培养基中，每100 ML瓶加入菌液200 ul，置于摇床中摇动培养，温度为28℃，转速为130 rpm，将菌液培养至分光光度值OD260 = 0.6后，放置于4℃冰箱保存)。用移液枪加入相应AS (终浓度为100 umol/L)，用保鲜膜封住瓶口，然后在膜上插几个小洞，方便透气，放置于摇床共培养，转速175 rpm，28℃侵染12 h。设置对照与处理(如图4)，对照种子浸泡后未进行任何处理，摇床培养用水培。
2.2.5. 清洗
清水冲洗处理过的花生种子。
2.2.6. 播种
播种花生畸宽20 cm，行距27 cm，每穴3~4粒，尽量保证土地平整。最后小心为花生萌发种子盖土，避免损伤种胚，盖土厚度为2~3 cm。
2.2.7. 田间筛选
播种后，每周观察一次花生的生长状况，在幼苗长到3~5叶期时，开始进行除草剂抗性田间筛选，共喷洒四次，各次间隔3周。第一次，1:1000浓度的草甘膦溶液，分别对仲恺花01和12号对照组和实验组进行均匀喷雾，挂好标签。第二次浓度1.5:1000，第三次浓度4:1000，第四次浓度7:1000。
2.2.8. 收获T1代并进行分子检测
收获抗草甘膦的花生T1种子，并继续播种，提取幼苗叶片DNA进行PCR分子检测。DNA提取采取SDS法，PCR扩增体系为25 ul，扩增引物序列为，上游引物：5‘-ACCATCGTCAACCACTACAT-3’，下游引物：5‘-AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3’，扩增产物片段大小为438 bp，引物由上海生物工程股份有限公司合成。
3. 结果与分析
3.1. T0代转化及大田筛选情况
从2018年4月28日第一次观察花生播种及喷药后生长情况到2018年7月28日收获花生，期间共4次喷药，5次对花生进行观察。由于第一、第二次花生喷药的浓度比较低，花生整体变化不大，生长旺盛，处理组和对照组的花生变化不明显，第三、第四次加大浓度后，对照喷药的植株叶子发黄，长势受抑制，甚至枯萎死亡(图5右边植株)，处理组的花生植株也大部分叶子发黄，枯萎，抗性好的植株长势良好(图5左边植株)。最后收获花生(图6)。
实验通过穿刺法辅助转化萌发种子仲恺花生01号900粒，仲恺花生12号600粒。不做任何处理空白对照仲恺花生01号100粒，空白对照仲恺花生12号70粒。将转化处理种子和空白对照种子直接播种于实验田中，播种后仲恺花生01号处理组出苗550株，出苗率为61.1% (表1)，对照组出苗75株，出苗率75%；仲恺花生12号处理组出苗率380株，出苗率63.3%，对照组出苗50株，出苗率83.3%。生长
期间，从第一次到第五次共3个月时间进行草甘膦除草剂喷洒筛选，经过喷洒处理的对照组花生植株全部枯萎死亡，实验组仲恺花生01号植株存活苗为5株，其中3株表现为低抗，2株表现为中抗；实验组仲恺花生12号植株存活苗6株，其中4株表现为抵抗，2株表现为中抗(表1)。
大田花生转化植株除草剂抗性筛选划分标准：
高抗(H)：整个植株叶片均为正常绿色，叶片挺拔。叶面上没有或仅有个别黄色斑块(相当于Mannerlof等的8~10级)，植物生长发育未受到影响。
中抗(M)：植株上绝大多数叶片为正常绿色，但是叶片出现轻微下披，生长速度减慢，少数叶片出现黄色斑块(相当于Mannerlof等的6~8级)。
低抗(L)：植株上部分叶片发黄，萎蔫，出现明显的受害症状。生长发育受到影响，但经过一段时间后植株仍能够恢复生长(相当于Mannerlof等3~5级)，植株表现出明显的耐性。
Table 1. Result of EPSPS gene transformation and screening of T0
表1. T0代转化处理情况
3.2. T1代种子出苗及生长情况
如图7所示，将T1代种子室内播种，20天后幼苗叶片供DNA提取。
3.3. 提取T1代花生叶DNA及分子检测
图8为T1代种子幼苗进行DNA提取的电泳图。如图可以看出DNA条带有降解，不清晰。主要原因是花生材料含有酚类和糖类物质比较多，DNA较难提取，电泳时干扰多。
Figure 7. Budding and growth of T1 generation (A: 2 d, B: 7 d, C: 20 d)
图7. T1代播种后种子的出芽与生长情况(A：2天，B：7天，C：20天)
图9为T1代DNA进行目的基因扩增的结果。如图所示，从扩增出的PCR的电泳图中看不到很明显的目的条带，但模模糊糊又似乎有，扩增效果差。应该进一步优化DNA提取和PCR扩增程序。可能的原因：1) 模板中含有杂质，DNA提取的质量差。2) 在提取制备模板时丢失过多，模板降解严重，导致模板量太少。
4. 讨论
4.1. 穿刺法处理萌动种子的影响
穿刺处理过的种子和没有处理的种子相比，穿刺过的种子存活率较低(表1)，植株长势较差。说明穿刺对花生胚造成较大伤害，不利于出芽。但造成伤害对农杆菌侵染及基因转化又是有利条件，所以本方法对穿刺的深度和面积等参数有严格的要求。
4.2. 除草剂的浓度对花生的影响
本实验第一次按1:1000的比例喷洒除草剂，由同一人以匀速喷洒除草剂，花生叶片出现枯黄、损伤，其他部位没有受到影响。第二次按1.5:1000的比例喷洒除草剂，花生植株子叶与第一次相比叶子发黄，少部分枯萎，生长状况差；少数植株生长旺盛，对草甘膦除草剂具有不同程度的抗性。由于前两次喷洒除草剂后还没有出现死亡植株，所以第三次加大浓度，按4:1000的比例喷洒除草剂，与前两次相比大部分植株叶子枯黄，枯萎，生长状况差，少数植株生长旺盛，但是还是没有死亡植株，所以进行第四次喷药，加大药量，按7:1000的比列喷洒除草剂，25天后观察，空白对照中喷洒除草剂后的植株全部死亡，处理中除少数可能转入转基因ESPSP的植株生长势良好(图5右)，大部分花生植株不具抗性，经过喷洒除草剂，叶片基本枯萎，最后死亡。
4.3. 大田抗性与分子检测结果
本实验经过大田四次筛选，结果很明显看出确实有些苗具有大田除草剂抗性(如图5)，生长状况比对照具有明显优势，但PCR分子检测却很不明显。对于这种现象，可能本实验对花生DNA提取和PCR检测方法不当；另外也可能是在本实验所用花生品种中本身具有此种抗性，经过筛选把它进一步富集加强且区分出来，而不是转基因的结果。需要进一步验证这两种可能性。
5. 结论
本实验尝试了利用金刚砂辅助超声波用农杆菌转化花生萌动种子，尽管最后分子检测的PCR结果不很明显，但还是获得具有明显大田抗性的植株，不失为一种可行的传统抗性育种筛选方法；另外，从转基因方面讲，毕竟是第一次尝试，从设计步骤和大田筛选结果看整个操作处理程序是可行的，也得到了大田抗性明显的植株。但是程序中的各级参数例如针刺的位置和深度、萌动时间、金刚砂的浓度和超声波强度等均需更细致的实验加以优化，尤其对DNA和PCR检测方法的优化。
通过本实验，摸索出利用金刚砂辅助超声波进行农杆菌转化花生萌动种子程序如下：1) 花生剥壳和恒温水28℃浸泡12小时；2) 穿刺处理萌动种子胚；3) 金刚砂和超声波处理穿刺的萌动种胚；4) 农杆菌共培养；5) 花生播种、田间管理与抗性筛选；6) T1代转化种子室内播种；7) 提取T1代花生叶DNA及分子检测。
基金项目
广东省大创基金，穿刺胚和金刚砂超声波辅助农杆菌转化法进行花生转基因(201711347062)。