摘要:
目的：本试验主要研究人工培育的蝉花虫草子实体对H22荷瘤小鼠免疫功能的影响。方法：40只ICR小鼠在腋下通过皮下接种H22肝癌小鼠腹水建立荷瘤小鼠的模型，接瘤24 h后进行随机分组，模型组、蝉花虫草子实体低、中、高剂量组、环磷酰胺阳性对照组，每组8只小鼠，共40只。蝉花虫草子实体低、中、高剂量组的小鼠分别按照75、150、450 mg/kg体重的剂量灌服蝉花虫草子实体生理盐水混悬液，每天1次；阳性对照组的小鼠按照20 mg/kg体重的剂量隔天腹腔注射环磷酰胺生理盐水溶液。连续给药14 d后，测各组小鼠的瘤体积、瘤重、肿瘤抑制率、脾脏指数、胸腺指数、血清免疫球蛋白和细胞因子含量、脾T淋巴细胞增殖能力。结果：各剂量组小鼠的瘤体积和瘤重均极显著低于模型组(P < 0.01)，四组小鼠的肿瘤抑制率分别为49.13%、55.72%、56.53%、62.59%；低、中剂量组小鼠脾脏指数和胸腺指数均高于模型组(P < 0.05)，高剂量组小鼠胸腺指数高于模型组(P < 0.05)，低剂量组OD值大于模型组(P < 0.05)；中、高剂量组和阳性对照组小鼠血清中IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-6和TNF-α含量均高于模型组(P< 0.05)。结论：人工培育的蝉花虫草子实体通过调节小鼠的免疫功能抑制肿瘤的生长。
Abstract:
Objective: To study the effect of artificial cultured Cordyceps cicadae on immune function of H22 tumor-bearing mice. Methods: 40 ICR mice were randomly divided into groups after 24 h of tumor-bearing mice, 8 mice in each group with low, medium and high dose group and cyclophosphamide positive control group. At 75, 150, 450 mg/kg body weight, the mice in the low, medium and high dose groups were fed with the suspension of physiological saline of Cordyceps cicadae fruit, each 1 day; mice in the positive control group were intraperitoneally injected with cyclophosphamide saline solution every other day at a dose of 20 mg/kg body weight. The tumor volume, tumor weight, tumor inhibition rate, spleen index, thymus index, serum immunoglobulin and cytokine content, spleen T lymphocyte proliferation ability of mice in each group were measured after 14 d of continuous administration. Results: The tumor volume and tumor weight of mice in each dose group were significantly lower than those in the model group (P < 0.01). The tumor inhibition rate in the four groups was 49.13%, 55.72%, 56.53%, 62.59%, respectively. The gland index was higher than that of the model group (P < 0.05), the thymus index of the mice in the high dose group was higher than that in the model group (P < 0.05), and the OD value in the low dose group was higher than that in the model group (P < 0.05). Conclusion: Artificially cultivated Cordyceps cicadae can inhibit tumor growth by regulating immune function in mice.
1. 引言
蝉花虫草(Cordyceps cicadae)是我国一种名贵的传统中药材，在我国其应用的记载比冬虫夏草的还要早200年，至少已有1500多年的应用历史 [1] [2]。有研究表明蝉花虫草具有改善肾功能、滋补强壮、免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗疲劳、抗应激及解热镇痛、镇静、降血糖、降血压等多种功效和药理作用 [3]。蝉花虫草在抗肿瘤和改善人体免疫方面也有着重要的作用。但是由于蝉花虫草野生资源匮乏，野生蝉花虫草已经不能满足市场的需求。而人工培育的蝉花虫草解决了野生蝉花虫草资源紧缺的问题。陈安徽等 [4] 发现人工培育的蝉花虫草和基质的甲醇相均具有很强的抗肿瘤活性。目前人工培育的蝉花虫草对H22荷瘤小鼠免疫和抗肿瘤方面的研究尚未报道，本研究就人工培育的蝉花虫草进行对H22荷瘤小鼠免疫功能调节作用和抗肿瘤活性的初步研究。
2. 材料与方法
2.1. 材料
2.1.1. 供试材料
样品：人工培育的蝉花虫草子实体由浙江泛亚生命科学研究院提供。
实验动物：雌性SPF级ICR小鼠(实验动物生产许可证号为SCXK(沪) 2017-0012，合格证号：0002012，初始体重18~22 g)购买自上海吉辉实验动物饲养有限公司。实验操作完全按照实验动物护理指南进行，并由实验动物伦理委员会审查通过。H22小鼠肝癌瘤株购于中国科学院。
2.1.2. 仪器与试剂
IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-6和TNF-α小鼠ELISA试剂盒购于上海博湖生物科技有限公司；环磷酰胺购于浙江省平湖市医药有限公司，批号19120225；酶标仪(TECANInfiniteM200Pro)购于瑞士帝肯公司。
2.2. 方法
2.2.1. H22荷瘤小鼠模型的建立、分组
按照常规复苏方法复苏H22小鼠肝癌细胞，然后取0.2 mL的细胞悬液注射到雌性ICR小鼠腹腔内，连续传代2次获H22腹水瘤小鼠；再参考文献 [5] 的方法，在超净工作台中，取H22腹水瘤小鼠腹水，用生理盐水清洗后稀释成浓度为1 × 106/mL细胞悬液，按照每只0.2 mL的接种剂量接种于经适应喂养5天后的ICR雌性小鼠的左侧腋部皮下。
40只ICR雌性小鼠在接种瘤株24 h后进行随机分为5个组：模型组(Modle)、蝉花虫草子实体低、中、高剂量组、环磷酰胺阳性对照组(CTX)，每组8只小鼠。
2.2.2. 给药
蝉花虫草子实体样品制备：分别取蝉花虫草子实体样品1.5、3.0和9.0 g，分别用1%的羧甲基纤维素钠配至200 mL，分别配置成浓度为0.0075 g/mL、0.015 g/mL和0.045 g/mL的样品。
环磷腺苷注射液制备：精确称取注射用环磷酰胺0.02 g，加生理盐水10 ml溶解稀释后，配置成浓度为0.002 g/mL的注射液。
给药方式及剂量：各组小鼠接种瘤株24 h后开始给药。模型组不给药，按照0.10 ml/10g的量仅给予蒸馏水，每天1次，连续14天。蝉花低剂量组给药量为0.075 g/kg；蝉花中剂量组给药量为0.15 g/kg；蝉花高剂量组给药量为0.45 g/kg；灌胃容积为0.10 ml/10g，每天1次，连续14天。阳性对照组腹腔注射环磷酰胺，按20 mg/kg体重的剂量，注射容积为0.10 ml/10g，每2天注射1次，连续14天(分别在第1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d注射)。
2.2.3. 瘤体积、瘤重和肿瘤抑制率测定
最后一次给药后的第二日，称体重后处死小鼠解剖取出瘤体，用游标卡尺测量瘤的体积并称取瘤重，计算肿瘤抑瘤率；
肿瘤抑制率 = (模型组平均瘤重 − 给药组平均瘤重)/模型组平均瘤重 × 100% (1)
2.2.4. 脾脏指数、胸腺指数测定
在超净工作台中无菌取出小鼠脾脏和胸腺，电子天平称重并记录，计算脾脏和胸腺指数。
脾脏指数(mg/g) = 脾脏质量(mg)/小鼠体重(g) (2)
胸腺指数(mg/g) = 胸腺质量(mg)/小鼠体重(g) (3)
2.2.5. ELISA法检测小鼠血清免疫球蛋白和细胞因子含量
小鼠摘眼球取血0.5~1.0 ml，4℃下3000 r/min 离心15 min，用移液枪仔细吸出血清置于−20℃保存备用，参照试剂盒说明书，利用酶联免疫(ELISA)法测定小鼠血清中IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-6和TNFα的含量。
2.2.6. MTT 法检测小鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力
无菌取出小鼠脾脏放入盛有预冷的5 ml PBS液的培养皿中，再将脾脏置于不锈钢网(200目)上，低温用5 ml注射器针芯研压脾脏，获脾细胞悬液后4℃下1500 r/min离心10 min，弃上清；加入2~3 ml冰预冷的红细胞裂解液充分打匀，37℃破红细胞5 min后1500 r/min离心7 min，弃上清；最后用PBS清洗细胞两次，加入含10%小牛血清的1640培养液配成1 × 106/ml脾细胞悬液。
ConA诱导的T淋巴细胞增殖实验：将脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1 ml，一孔加75 ul ConA液，另一孔作为对照，置二氧化碳培养箱中培养72 h。培养结束前4 h，每孔轻轻吸去上清液0.7 ml，加入0.7 ml不含小牛血清的1640培养液，同时加入MTT (5 mg/ml) 50 ul/孔，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔做3个平行，用酶标仪，以570 nm波长测定光密度值。
2.2.7. 数据统计分析
结果用平均值 ± 标准差(x ± s)表示，所有数据均用spss统计软件进行单因素方差分析。以P < 0.05 为差异有显著性。
3. 结果与分析
3.1. 瘤体积、瘤重和肿瘤抑制率的比较
在实验期间，各个剂量组的小鼠活动均未出现异常。各剂量组小鼠的瘤体积和瘤重均极显著低于模型组(P< 0.01)；蝉花虫草子实体低、中、高剂量组和阳性对照组的肿瘤抑制率分别为49.13%、55.72%、56.53%、62.59%。见表1。
Table 1. Comparison of tumor volume and tumor weight (X ± S, n = 8)
表1. 瘤体积、瘤重的比较(X ± S, n = 8)
注：与模型组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。
3.2. 脾脏指数、胸腺指数、ConA诱导状态下的脾T淋巴细胞增殖反应的OD值比较
结果表明蝉花虫草子实体低、中剂量组小鼠脾脏指数显著高于模型组(P < 0.05)。各个剂量组小鼠的胸腺指数和模型组的均有统计学意义(P < 0.05)，其中蝉花虫草子实体低、中剂量组小鼠胸腺指数极显著高于模型组(P < 0.01)，蝉花虫草子实体高剂量组小鼠胸腺指数显著高于模型组(P < 0.05)。ConA诱导状态下的脾T淋巴细胞增殖反应：蝉花虫草子实体低剂量组和阳性对照组OD值显著大于模型组(P < 0.05)。见表2。
Table 2. Comparison of spleen index and thymus index (X ± S, n = 8)
表2. 脾脏指数、胸腺指数的比较(X ± S, n = 8)
注：与模型组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。
3.3. 血清免疫球蛋白和细胞因子含量
各个剂量组小鼠血清中IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-6和TNF-α含量与模型组的比较均有统计学意义(P < 0.05)，其中，高剂量组和阳性对照组小鼠血清中IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-6和TNF-α含量均极显著高于模型组(P < 0.01)，中剂量组小鼠血清中IgA、IL-2、IL-6和TNF-α含量均极显著高于模型组(P < 0.01)；中剂量组小鼠血清IgG、IgM含量显著高于模型组(P < 0.05)；低剂量组小鼠血清IgG含量显著高于模型组(P < 0.05)。见表3。
Table 3. Contents of serum immunoglobulin and cytokines (X ± S, n = 8)
表3. 血清免疫球蛋白和细胞因子含量(X ± S, n = 8)
4. 结论与讨论
免疫球蛋白是反映机体体液免疫功能的重要指标，研究表明多种天然中药对免疫球蛋白IgA、IgG、IgM有着正向调节作用 [6]。本研究中，人工培育的蝉花虫草子实体能明显提高H22荷瘤小鼠血清中IgA、IgG和IgM含量，说明人工培育的蝉花虫草子实体能通过调节免疫球蛋白的含量起到免疫保护作用；IL-2、IL-6和TNF-α等细胞因子可通过结合相应受体调节细胞生长、分化，调控免疫应答 [7]。本研究中，人工培育的蝉花虫草子实体可促进淋巴细胞的增殖，增强巨噬细胞的吞噬能力，并可刺激淋巴细胞IL-2、IL-4和巨噬细胞TNF-α的分泌效果，间接提高B细胞、T细胞、NK细胞的免疫功能，在抑制肿瘤生长的特异性免疫反应中起到重要作用 [8]。
脾脏、胸腺是机体两个重要的免疫器官，是淋巴细胞分化和成熟的重要场所，其指数的大小一定程度上可以反映器官中免疫细胞的数量、体现免疫水平的高低，反映机体免疫功能的强弱 [9] [10] [11]；同时机体内淋巴细胞数量的增加及转化率的提高亦可促进淋巴因子的产生，是反映机体细胞免疫功能的重要指标。本研究发现人工培育的蝉花虫草子实体能显著提高H22荷瘤小鼠的脾脏和胸腺指数，促进小鼠免疫器官的发育，增强免疫功能；人工培育的蝉花虫草子实体能在ConA诱导状态下提高脾T淋巴细胞增殖能力，进而激活和促进脾淋巴细胞的增殖分化从而增强细胞免疫功能。
人工培育的蝉花虫草子实体极显著的降低了H22荷瘤小鼠的瘤体积和瘤重，其中低、中、高剂量组的肿瘤抑制率分别为49.13%、55.72%、56.53%，已非常接近阳性对照组62.59%的抑瘤率，具有良好的抗肿瘤效果。综上所述，推断人工培育的蝉花虫草子实体抗肿瘤机制可能与其能促进机体的免疫系统活性有关，可促进肿瘤细胞的凋亡达到抗肿瘤的效果，并对免疫系统有着一定程度的保护和修复作用。人工培育的蝉花虫草子实体在体内的抗肿瘤作用也可能还存在其他的作用机制，需要做进一步的研究。
参考文献
NOTES
*通讯作者。