1. 引言
冠状动脉粥样硬化是心血管疾病中威胁人类生命健康的主要疾病之一 [1]。心血管支架植入治疗是治疗该疾病最有前景的一种治疗方式，但是对于血管植入材料面临许多急需解决的问题，例如平滑肌细胞的快速生长，血液相容性差或内皮化速率慢 [2]。316L不锈钢作为心血管支架基材，后期生物相容性不好，长期存在体内会释放有毒金属离子触发局部免疫反应和炎症反应，进而可能引起内膜增生和支架内再狭窄 [3]。因此，越来越多的生物材料要求具有各种生物功能以获得理想的功能效果。
表面改性是实现植入材料表面多功能化的常用方法之一。目前被广泛采用的表面改性方法也存在许多限制，如仪器设备昂贵、操作繁杂、反应条件和改性基底要求严格，需要界面改性剂和表面之间的化学特异性 [4] [5]。此外，许多改性后固定的功能分子稳定性差，容易损失，有的材料表面无法提供足够的活性位点导致生物分子接枝量少，有的功能转化涂层具有一定的生物毒性，不能获得理想的表面改性效果 [6] [7]。
为了改善上述问题，需要开发一种低廉，操作简单，适用于多种生物材料，可固定多种生物功能分子的新型表面改性方法。原儿茶醛，一种含有邻酚羟基结构的分子，该物质不仅价格低廉，易获取，而且是常用中药丹参水溶性成分丹酚酸B降解的主要产物之一，具有抗动脉粥样硬化、降低心肌耗氧量、抑制血小板聚集 [8]、神经保护、抗脓血、抗病毒、抗纤维化等广泛的药理活性 [9]。本文借鉴聚多巴胺的沉积原理 [10]，将小分子多酚(原儿茶醛，DBA)与多胺(三(2-氨基乙基)胺，TAEA)在碱性条件下，发生交联聚合在316L不锈钢表面制备了DBTA有机转化涂层，通过各种材料学表征和结构表征，了解成膜过程以及反应原理，并研究了DBTA涂层的血液相容性和细胞相容性。
2. 实验部分
2.1. 实验材料及设备
原儿茶醛，DBA，纯度98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三(2-氨基乙基)胺，纯度96%，成都华夏化学试剂有限公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris，纯度98%)；去离子水，成都金山试剂厂；其他化学试剂均来自成都科龙试剂有限责任公司，纯度为分析纯。
傅立叶反射红外光谱仪(NICOLET 5700，美国Thermo公司)；X射线光电子能谱仪(Fisher K-Alpha，美国Thermo公司)；水接触角测量仪(DSA100，德国KRUSS公司)；扫描电子显微镜(FESEM，荷兰FEI公司，QUANTA200)。
2.2. DBTA有机转化功能涂层的制备
将316L不锈钢棒材切割成φ 10 mm，厚度1.5 mm的圆片，在抛光机上进行机械打磨抛光至镜面。将抛光的316L SS依次用丙酮、无水乙醇、去离子水在超声清洗设备中清洗3~5 min，每种试剂清洗三次，烘干后密封备用。配制Tris缓冲液：按照1.2 g/L浓度配制Tris-base缓冲液，用盐酸调节至pH = 8.5左右，保存备用。
DBTA涂层制备：将原儿茶醛DBA和TAEA三(2-氨基乙基)胺如表1所示参数投料，首先将处理后的316L不锈钢放入培养皿中，随后加入配置好的原儿茶醛和三(2-氨基乙基)胺的Tris溶液，控制环境温度为20℃反应12 h，去离子水清洗3次，重复上述成膜过程，总共沉积三次，DBA和TAEA成膜制备示意图如图1所示。
Table 1. The molar weight of DBA and TAEA used in the organic conversion coating of protocatechualdehyde
表1. 原儿茶醛有机转化涂层所采用的DBA与TAEA摩尔量
Figure 1. Schematic diagram of the preparation of DBTA coating on the 316L SS
图1. 在316L SS表面制备DBTA涂层的示意图
2.3. DDBTA涂层材料学表征
2.3.1. 傅里叶红外光谱(FTIR)表征
通过红外光谱分析可以表征材料组成与结构。本文采用红外衰减全反射法(ATR-FTIR)表征成膜后的表面官能团和组成的变化。
2.3.2. X射线光电子能谱(XPS)表征
X射线光电子能谱是表征材料表面元素组成及对应元素化学键合状态的定量分析能谱技术。本文采用Fisher K-Alpha型X射线光电子能谱仪进行检测，阳极靶为A1靶，X射线能量hν为1486.6 eV，分析条件为10−20 KV工作电压，真空度2 × 10−9 Torr。
2.3.3. 表面官能团定量表征
涂层表面的胺基定量分析通过酸性橙(AO II)法来检测 [11]。其原理是在酸性条件下，酸性橙的磺酸基带负电，可与样品表面带正电的氨基结合，从而使样品染色。接着在碱性条件下将结合的酸性橙解离，检测解离液在485 nm的吸光度值，对比标准曲线可得出样品表面的胺基含量。采用Micro-BCA法检测样品表面酚羟基的密度 [12]，在碱性环境中酚羟基可使Cu2+还原为Cu+，并与双喹啉酸反应形成紫色配合物，在562 nm处测定吸光度。
2.4. 血小板粘附与激活实验
将新鲜的人血加入离心管中，以1500 rpm转速下离心15 min，得到顶层富血小板血浆(PRP)。然后，在每个样品表面加入60 ul的PRP放置在24孔板，37℃孵育45 min。然后用0.9 wt% NaCl溶液仔细冲洗样品以去除不牢固粘附的血小板。2.5 wt%戊二醛溶液固定12 h后，用蒸馏水洗涤3次。将吸附在表面的血小板依次用40、50、70、90和100 vol%的乙醇/水溶液脱水15 min。样品经自然干燥后喷金，扫描电子显微镜观察血小板形态变化。
2.5. 内皮和平滑肌细胞相容性
选择内皮细胞(ECs)和平滑肌细胞(SMCs)进行体外细胞相容性评价。从新生儿脐带中分离出内皮细胞和平滑肌细胞，细胞在37℃和含5% CO2的培养箱中培养。先将样品置于24孔板上，然后将1 × 104细胞密度的内皮细胞和平滑肌细胞悬液直接接种到有样品的孔中，在添加10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养1天和3天，洗涤后用2.5%戊二醛固定过夜。进一步，将细胞用罗丹明123染色15 min，然后，在荧光显微镜下观察所有样品表面的细胞形态。细胞增殖试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖情况。
2.6. 统计学分析
AO II和Micro-BCA测定，以及血液和细胞实验至少重复三次，并准备四到五个平行样品。所有定量结果以平均值±标准偏差(SD)来表示。各组样品结果差异采用单因素方差(One way ANVOA)分析法，以评估统计显著性。*P < 0.05被认为是统计学上的显著差异。
3. 结果与讨论
3.1. 涂层反射红外光谱表征
图2为不同投料量的DBTA涂层的红外光谱。可以看到，D2T1、D1T1和D1T1样品在3371 cm−1附近出现的宽峰，是DBA中酚羟基O-H和TAEA中氨基N-H伸缩振动，在1600~1450 cm−1处存在的吸收峰是苯环骨架的C=C伸缩振动峰，它是苯环特征吸收峰，来源于形成涂层的原单体DBA中的特征官能团。在1658 cm−1附近的吸收峰是C=O、C=N的伸缩振动峰，归因于氧化的儿茶酚结构以及氧化儿茶酚与氨基之间发生的席夫碱反应。此外，在1330~1270 cm−1是芳香族仲胺和叔胺的C-N振动峰，说明与苯环和伯胺基发生了迈尔克加成反应有关。红外结果显示，在316L SS表面上不同投料比都能成功构建DBTA有机转化功能涂层。
Figure 2. ATR-FTIR spectra of coating surface of different samples
图2. 不同样品涂层表面的红外光谱
3.2. 涂层表面XPS分析
为进一步研究不同投料比的DBTA涂层中元素的化学键合状态，采用XPS对有机转化涂层中各元素进行了全谱扫描(图3(a))并对涂层中相关元素进行了高分辨图谱分析(图3(b))。全谱扫描结果如图3(a)所示，所有样品表面都出现了C、N、O的元素信号，而SS表面没有出现N元素的峰，其余样品C、N、O的元素信号明显加强，说明SS表面均有DBA和TAEA的沉积。进一步对C1s、N1的高分辨图谱进行曲线拟合，如图3(b)所示。C1s高分辨谱被分为五种可能的键合状态，C1：283.8 eV (苯环骨架的C)；C2：284.4 eV (脂肪族C-C、C-H)；C3：285.5 eV (脂肪族C-N、芳香族C-N)，分别归属于TAEA中的伯胺基以及TAEA与DBA迈克尔加成反应产生的芳香族C-N；C4：286.7 eV (芳香族C=N、C-OH)，C=N来自于席夫碱反应产生的芳香族结构；C5：288.3 eV (醌基和醛基C=O)。N1s高分辨谱可以分为四种键合状态，N1：399.0 eV (TAEA伯胺C-N)；N2：399.6 eV (芳香族C=N)；N3：400.2 eV (芳香族C-N)；N4：401.3 eV (TAEA叔胺C-N)。该结果表明DBTA有机转化涂层的成功构建，进一步证明涂层制备过程中DBA和TAEA发生了迈克尔加成和席夫碱反应形成交联分子粘附到基底材料上。
3.3. 表面官能团定量表征结果
作为一种生物材料表面有机转化功能涂层，表面官能团是后续生物功能化的基础。为了获得表面酚羟基和胺基的密度，分别用Micro-BCA和酸性橙(AOII)比色法对酚羟基和胺基进行选择性标记。如图4所示，相比于SS表面，DBTA涂层明显保留了大量的胺基和酚羟基官能团，官能团密度最大值分别为32.1 ± 1.9 nmol/cm2和25.3 ± 1.8 nmol/cm2。从图4(a)可以看出，随着胺分子比例的增加，胺基密度增大，D1T2样品的胺基密度达到最大值。从图4(b)可以看出，随着DBA分子比例的增加，酚羟基密度增大，D2T1酚羟基的密度达到最大值。结果表明，我们可以通过不同的投料比成功引入不同的官能团密度，实现涂层表面功能基团含量的可调控性。
Figure 3. (a) XPS survey scan spectra of SS、D2T1、D1T1 and D1T2A; (b) High-resolution C1s and N1s XPS spectrum of SS, D2T1, D1T1 and D1T2
图3. (a) SS、D2T1、D1T1和D1T2涂层的XPS全谱分析；(b) SS、D2T1、D1T1和D1T2涂层的C1s和N1s高分辨图谱
Figure 4. (a) Density of amine (-NH2) and (b) phenolic hydroxyl (-OH) groups on the surface of different samples. (0.001 < **P < 0.01, ***P < 0.001, mean ± SD, N = 5)
图4. 不同样品表面胺基官能团(a) 和酚羟基官能团；(b) 密度定量结果(0.001 < **P < 0.01, ***P < 0.001, mean ± SD, N = 5)
3.4. 血小板粘附实验
对于心血管植入材料而言，材料表面的抗凝血性能是首要解决的问题，因此我们评价了不同样品表面的血小板粘附与激活情况，从样品表面血小板SEM图片(图5(a))和血小板计数结果(图5(b))可以看出，D1T2涂层表面血小板粘附量明显多于SS和其余样品且血小板出现了聚集，D2T1、D1T1表面粘附量较少于SS样品，同时D2T1表面的血小板聚集程度低于其余样品，这归因于D2T1样品中原儿茶醛的含量最多，可以抑制血小板的聚集。从血小板粘附形态来看，文献已有报道血小板在材料表面粘附有5种形态，分别为圆形、树枝状、树枝状铺展、铺展和完全铺展的形态 [13]，激活程度依次提高。发现所有样品组均呈现不同程度的激活状态，血小板伸出大量伪足，其中D1T1和D1T2部分血小板完全铺展，激活程度高于SS表面的血小板，这是因为相比于SS表面，改性后的D2T1、D1T1和D1T2样品表面通过官能团定量表征存在大量胺基官能团，表面的胺基官能团呈正电性，可以促进带负电荷的血小板的粘附与激活，这与很多文献报道胺基表面可以促进血小板的粘附与激活相一致 [14] [15]。
Figure 5. (a) Morphology platelet adhesion on different surfaces of samples; (b) Amounts of platelet attached onto different surfaces of samples (0.01 < *P < 0.05, 0.001 < **P < 0.01, ***P < 0.001, mean ± SD, N = 5)
图5. (a) 不同样品表面血小板粘附的SEM图像；(b) 不同样品表面血小板粘附计数结果(0.01 < *P < 0.05, 0.001 < **P < 0.01, ***P < 0.001, mean ± SD, N = 5)
3.5. 内皮细胞培养实验结果
心血管植入物表面内皮化对于植入材料而言是至关重要的，为了研究内皮细胞在材料表面的生长行为，我们评价了样品表面内皮细胞粘附与增殖实验。从图6(a)内皮细胞罗丹明染色照片可以看到，细胞培养1天时，三种涂层表面细胞数量没有明显差异，当培养3天后，所有样品表面细胞明显发生了增殖，其形态都呈椭圆形或者圆形，图6(b)显示了SS、D2T1、D1T1和D1T2涂层的内皮细胞CCK-8结果，可以看到内皮细胞培养1天时，三种涂层的CCK-8都与SS没有明显差异，培养3天后，D2T1、D1T1相比于SS吸光度值有所降低，D1T2略高于SS对照样而明显高于其余样品组，说明D2T1、D1T1对内皮细胞有轻微毒性，但D1T2有利于内皮细胞的增殖。已有研究表明，中低密度的酚羟基有利于内皮细胞的存活 [16]，表面官能团定量结果显示D1T2具有相对较低的酚羟基密度，因此会促进内皮细胞的粘附与增殖。
3.6. 平滑肌细胞培养实验结果
心血管支架表面抑制平滑肌细胞的粘附与增殖是降低支架再狭窄的有效途径之一，因为我们除了对内皮细胞，进一步研究了DBTA涂层与平滑肌细胞的相互作用。从图7(a)平滑肌细胞罗丹明染色照片可以看到，细胞培养1天时，三种涂层表面细胞数量没有明显差异，当培养3天后，所有样品表面细胞明显发生了增殖，D2T1、D1T1表面平滑肌形态都呈显正常的细长、纺锤状，而D1T2表面出现很多呈短棒状的平滑肌。图7(b)显示了SS、D2T1、D1T1和D1T2涂层的平滑肌细胞CCK-8结果，可以看到平滑肌细胞培养1天时，三种涂层的CCK-8都与SS没有明显差异，培养3天后，D2T1、D1T1相比于SS没有显著性差异，而具有高胺基密度的D1T2的吸光度值低于SS，对平滑肌的增殖有一定抑制作用，有研究表明高活性酚羟基表面对平滑肌细胞活力和增殖的抑制作用较弱，一定量的胺基能够抑制平滑肌细胞的增殖 [16]。
Figure 6. (a) Immunofluorescence staining of ECs on different sample surfaces；(b) CCK-8 results of ECs on different sample surfaces(0.01 < *P < 0.05, 0.001 < **P < 0.01, mean ± SD, N = 5)
图6. (a) 不同样品表面内皮细胞免疫荧光图片；(b) 不同样品表面内皮细胞CCK-8结果(0.01 < *P < 0.05, 0.001 < **P < 0.01, mean ± SD, N = 5)
Figure 7. (a) Immunofluorescence staining of SMCs on different sample surfaces; (b) CCK-8 results of SMCs on different sample surfaces (0.01 < *P < 0.05, mean ± SD, N = 5)
图7. (a) 不同样品表面平滑肌细胞免疫荧光图片；(b) 不同样品表面平滑肌细胞CCK-8结果(0.01 < *P < 0.05, mean ± SD, N = 5)
4. 结论
本工作通过简单的一步法在316L SS表面上制备了DBTA有机转化功能涂层，并增加了表面胺基、酚羟基官能团的数量，不同的投料比可以调控涂层表面官能的密度与种类，可为后续的功能分子固定改性提供更好的平台。FTIR和XPS结果表明，成膜过程中发生了迈克尔加成反应和席夫碱反应，形成共价交联的涂层。同时，血小板黏附结果表明DBTA涂层会导致血小板激活程度增加。细胞培养结果表明，DBTA涂层对内皮细胞和平滑肌细胞无明显的细胞毒性作用，具有一定的生物相容性，其中D1T2可以促进内皮细胞的增殖，抑制平滑肌细胞的增殖，具有植入材料理想的生物学行为。综上所述，DBTA有机转化功能涂层不仅提供了有效的表面改性方法，同时也为血管植入材料表面生物修饰的进一步应用开辟了的新途径。
基金项目
国家自然科学基金(32071328)，四川省国际合作项目(2020YFH0103)。
NOTES
*通讯作者。