一株耐镉真菌的鉴定及其吸附性研究

Identification and Biosorption Characteristics of a Cadmium Resistant Fungus

摘要: 目的：以采于个旧市老厂尾矿区周边土壤中筛选出的一株耐镉菌株(编号：IS0675-1)为试验材料，对该菌株进行初步鉴定和吸附性研究。方法：采用形态学观察、系统发育学分析对该菌株进行初步鉴定，并探究菌株在温度、重金属浓度、菌量、pH梯度下对重金属的吸附特性。结果：耐镉菌株(IS0675-1)初步鉴定属于枝孢属(Cladosporium)，温度为40℃，pH = 6，Cd²⁺浓度为50 mg/L，菌量0.3 g时IS0675-1菌株吸附重金属镉(Cd²⁺)的整体效果最佳。

Abstract: Objective: A cadmium tolerant strain (IS0675-1) was isolated from the surrounding soil of Laochang tailings area in Gejiu City. The strain was preliminarily identified and its adsorption capacity was studied. Methods: Morphological observation and phylogenetic analysis were used to preliminarily identify the strain, and to explore the adsorption characteristics of the strain under temperature, heavy metal concentration, bacterial biomass and pH gradient. Results: The results showed that the cadmium tolerant strain (IS0675-1) belonged to Cladosporium. When the temperature was 40˚C, pH = 6, the concentration of Cd²⁺ was 50 mg/L, and the amount of strain was 0.3 g, the overall adsorption effect of IS0675-1 was the best.

1. 引言

在开发矿产资源的同时，伴随着重金属对土壤、地下水、环境及农作物的影响 [1]。部分文献资料 [2] [3] [4] 表明，矿区周围土壤中重金属污染严重。镉(Cd)、砷(As)、铅(Pb)和铬(Cr)等重金属元素在矿区周围的土壤中均出现富集的现象。重金属镉(Cd)具有较强的迁移能力，矿产资源开采的过程中产生的废矿、废渣中的镉可直接或间接的向周围的土壤和地下水等周围环境中迁移扩散 [5]。采矿之后的矿区废弃地不仅占用大量的土地资源，还对周围的植被造成了破坏，且土壤理化性质差，植物难以生长 [6]。在进行土壤重金属污染修复时，需要充分考虑技术可行性、污染状况、施工周期和工程费用等因素 [7] [8]。土壤重金属污染修复技术中，生物修复技术治理效果好、操作简单、适用范围广、治理成本低廉，日益受到人们的重视 [9]。微生物的抗性和解毒作用也被积极应用在环境保护中，来实现重金属污染土壤的修复，但同时也存在一定的局限性 [10] [11]。环境条件(如温度、pH、水分等)会对微生物的活性产生影响，并且受环境因素的影响较大。所以还需进一步进行对耐重金属菌株的生物特性以及吸附特性进行研究，对土壤修复提供比较实际的理论依据。本研究菌株来源于前期课题组成员通过平板划线法筛选一株能耐受500 mg/L镉(Cd²⁺)浓度的真菌(编号：IS0675-1)，该菌株采集于个旧老厂尾矿区根际土壤，通过形态学特性、分子生物学方法鉴定菌种；同时探索不同温度、pH、Cd²⁺浓度、菌量条件下该菌株对重金属镉的吸附特性研究。为治理本地重金属镉污染土壤提供优质的菌株。

2. 材料与方法

2.1. 材料

菌株来源于前期课题组筛选出的一株耐镉菌株(编号：IS0675-1)，能耐受Cd²⁺ 500 mg/L浓度。菌株采集于个旧市老厂尾坝矿区根际土壤(北纬23˚15'56~23˚21'39，东经103˚07'28~103˚09'14)。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(g/L)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18.0 g，水1 L。硝酸镉(天津市复精细化研究所生产，分析纯)。ICP-OES分析仪(美国perkinelmer公司，optima 8000)。

2.2. 方法

2.2.1. 耐镉菌株纯化

将前期课题组挑选出的耐镉能力强的IS0675-1在平板上划线转接3次以上进行菌株纯化 [12]，并挑选长势好、菌落饱满的单菌接种到马铃薯培养基平板，进行下一步菌株鉴定和吸附性能研究。

2.2.2. 耐镉菌株的形态观察与鉴定

分离和纯化后获得的菌株接种到马铃薯培养基平板中央，28℃培养10 d，观察菌落形态。同时，IS0675-1菌株送上海生工生物工程有限公司测序。将序列进行Blast序列分析，确定各菌株边缘种及相似性。使用MEGA 5.2 软件构建系统发育树。

2.2.3. 耐镉菌株对镉吸附性能研究

在无菌的三角瓶中加入去离子水，采样单因素实验，选择不同温度、pH、重金属浓度、菌量，分别接种微生物菌丝，置于摇床培养，具体实验过程见表1。实验结束后，用滤纸过滤菌丝，用ICP-OES测定溶液中残余的Cd的浓度，同时设置对照实验，三次重复。

Table 1. Biosorption experiment design

表1. 吸附实验设计

2.2.4. 重金属镉吸附率

重金属吸附率 = (空白样品重金属浓度 − 实验样品残留浓度)/空白样品重金属浓度 × 100%。

2.3. 数据处理

实验数据采用Excel 2013分析，利用SPSS 20.0进行单因素方差分析(ANOVA)和Duncan检验多重比较(P < 0.05)，结果以平均值 ± 标准差表示。

3. 结果与分析

3.1. 菌株的形态观察

由图1可以看出，IS0675-1菌株菌落呈褐绿色凸点状，外部及边缘菌丝呈白色绒毛状，较为致密；菌落呈凸起状，圆形向四周扩散；铺散在培养基表面，从中央向四周发散，菌落背面呈现墨绿色。菌丝有分隔，分生孢子梗直立，分身孢子呈椭圆形或者梭型，初步鉴定为暗色孢科。IS0675-2菌株的菌落成乳白色绒毛状，多呈现圆形点状分布，四周相对整齐，白色菌丝紧贴平板上。菌丝并未有发现明显的孢子的迹象。

3.2. 菌株的鉴定

将筛选出的IS0675-1菌株送上海生工生物工程有限公司测序。通过Ezup柱式真菌基因组DNA抽取试剂盒提取菌株DNA，进行PCR扩增，基因测序结果显示IS0675-1菌株的长度约为525 bp (见图2)。使用核糖体数据库(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)在线对比分析，结果显示IS0675-1菌株与其系列同源性高的菌株有10株，同源性都达到了100%。登录号分别为MK813961.1，MK813962.1，MK813959.1，MN077441.1，MN128233.1，MK355726.1，MN186996.1，MN186740.1，MK780233.1，MN696552.1。结合NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在线分析以及图3系统发育树分析，初步鉴定IS0675-1菌株属于枝孢菌属(Cladosporium)。

Figure 1. Colony morphology

图1. 菌株菌落形态

Figure 2. Results of PCR amplification

图2. PCR扩增结果

Figure 3. Phylogenetic tree of IS0675-1

图3. IS0675-1系统发育树

3.3. 耐镉菌株的吸附特性研究

3.3.1. 温度

由图4可知，菌株IS0675-1在不同的温度下，对重金属镉(Cd²⁺)的吸附特性具有一定影响，随温度增加表现出增加趋势，各处理表现各异。其中，40℃处理下最大达72.2%，其次30℃达65.85%，最少的处理为20℃达65.75%，40℃处理下吸附率比30℃，20℃分别高出6.35%、6.45%，但各处理之间未达显著差异。

Figure 4. Effect of temperature on the adsorption rate of IS0675-1 strain

图4. 温度对IS0675-1菌株吸附率影响

3.3.2. pH

由图5可知，菌株在不同的pH处理下表现出的吸附率也不相同。pH6的处理下IS0675-1菌株的吸附率最大达68.85%，其次为pH8处理吸附率为62.6%，pH4处理下菌株的吸附率最低，只有58.65%。pH对IS0675-2菌株的吸附率存在很大的影响，其吸附曲线与pH有一定的相关性。在pH在4~8的范围时，随着pH的增加吸附率逐渐增加。pH值为4、6、8的吸附率分别达到67.9%、82.6%、79.6%，以pH = 8的吸附效果较好。

Figure 5. Effect of pH on the adsorption rate of IS0675-1 strain

图5. pH对IS0675-1菌株吸附率影响

3.3.3. 重金属浓度

由图6可知，菌株对Cd²⁺的吸附率随重金属浓度的增加，表现出减少的趋势。50 mg/l处理下菌株吸附率最大为89.6%，其次100 mg/l处理下菌株的吸附率为46.53%，200 mg/l处理下吸附率最低仅为46.53%。经过方差分析，发现50 mg/L处理与100 mg/L和200 mg/L处理达显著差异。100 mg/L处理和200 mg/L处理达显著差异。

3.3.4. 菌量

由图7可知，不同菌量的菌株IS0675-1对重金属镉的吸附量也不同，在一定的菌量范围内，该菌株的吸附率随着菌量增加而升高。菌量0.3 g处理下菌株对重金属镉(Cd²⁺)的吸附率最大达到76.4%，0.2 g菌量的吸附率为67.28%，菌量为0.1 g处理下的吸附率最低仅56.55%。菌量0.3 g处理下吸附率比菌量为0.1 g时高出19.85%，比0.2 g菌量高出9.12%。

Figure 6. Effect of heavy metal concentration on adsorption rate of strain IS0675-1

图6. 重金属浓度对IS0675-1菌株吸附率影响

Figure 7. The effect of the amount of bacteria on the adsorption rate of IS0675-1 strain

图7. 菌量对IS0675-1菌株吸附率影响

4. 讨论与结论

本研究采用来自于前期在个旧市老厂尾坝矿区土壤中筛选出的一株耐镉菌株编号：IS0675-1，经初步分析鉴定，鉴定出该菌株为枝孢菌属，属于半知菌亚门。前人关于半知菌亚门其他属的研究还有很多，如马连营等 [13] 从粤东北梅州市梅县尾矿废弃地分离出的一株耐镉(Cd²⁺)浓度15 mmol/L以上的真菌菌株6~20 p，经鉴定为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus Samson)。胡南 [14] 等人从博落回根部土壤筛选出的一株耐镉真菌A-2，属于镰刀菌属(Fusarium sp.)，魏本杰 [15] 从株洲冶炼厂分离出一株耐镉真菌属于拟青霉属(Paecilomyces lilacinus M1)，它能在40 mmol/L的液体培养基中生长；本次实验经筛选鉴定发现了新的耐重金属镉的枝孢菌属，目前还没有枝孢菌属修复重金属土壤的相关研究，为治理重金属镉污染土壤提供了新的菌株。

真菌对重金属的吸附能力受温度、pH、重金属浓度、菌量等多因素的影响。马连营等 [13] 从粤东北梅州市梅县尾矿废弃地分离出的真菌菌株6~20 p拟青霉属(Paecilomyces lilacinus)，温度为30℃时吸附率最佳为56.6%，pH增大到3.5时菌体对重金属镉(Cd²⁺)吸附率最佳去除率为56.3%，同时包括时间条件的对比，108 h时达到最佳吸附率56.8%。刘云国 [16] 等利用简青霉(Penicillium simplicissimum)和黑曲霉(Aspergillus niger)吸附镉(Cd²⁺)的最佳pH值为5，本次试验中最佳pH与以上试验中最佳的pH相比有较大差距，可能是由于菌株本身对pH的耐受性不同造成的最佳pH的不同。本实验中菌株IS0675-1的重金属吸附能力受重金属浓度的影响最为明显，当环境重金属的浓度较低时，如50 mg/l时菌株的吸附能力达到了本次实验中的最佳值89.6%，200 mg/L时吸附能力大幅度的降低仅有46.53%，达到本实验中吸附率的最低值。研究以上的因素对重金属吸附的影响，对优化菌株的吸附条件提高其吸附能力有重要意义，也将有利于菌株的合理利用。综上所述，温度为40℃，pH = 6，Cd²⁺ 50 mg/L，菌量0.3 g时为IS0675-1菌株吸附重金属镉(Cd²⁺)的整体最佳条件。不同菌量和温度对重金属镉的吸附量也不同，在一定的菌量和温度范围内，随菌量与温度升高，菌株对重金属镉(Cd²⁺)的吸附率呈现增加的趋势。

基金项目

云南省地方本科高校联合基金专项项目——青年项目(矿区重金属复合污染土壤中菌肥–土壤–玉米协同修复机理研究2018FH001-115)，红河学院大学生创新创业训练计划项目(DCXL190029)。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。