MicroRNA在肝纤维化中的研究进展

Research Progress of MicroRNA in Liver Fibrosis

摘要: MicroRNA是一类短链非编码RNA，主要通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后表达的调控。肝星状细胞的活化和信号通路的激活是肝纤维化发生发展的中心环节，miRNA能够通过调控肝星状细胞的活化、凋亡和肝纤维化相关信号通路，从而在肝纤维化过程中发挥重要的作用。本文就miRNA在肝纤维化过程中的作用进行综述。

Abstract: MicroRNA is a type of short non-coding RNA, which mainly uses specific base pairing with target mRNA to cause degradation of target mRNA or inhibit its translation, thereby regulating gene expression after transcription. The activation of hepatic stellate cells and the activation of signaling pathways are the central link in the occurrence and development of liver fibrosis. miRNAs can play a role in the process of liver fibrosis by regulating the activation, apoptosis of hepatic stellate cells and signaling pathways related to liver fibrosis. This article reviews the role of miRNA in the process of liver fibrosis.

1. 前言

肝纤维化是慢性肝病发展为肝硬化的中间阶段。各种因素(如病毒、乙醇、寄生虫、药物等)可导致慢性肝损伤的改变。主要的病理变化是肝组织受到各种刺激后进一步激活肝星状细胞(HSC)，HSC转化为肌成纤维细胞，并大量分泌转化生长因子-β (TGF-β)、结缔组织生长因子(CTGF)等，肝脏自身的这种自我修复过程进一步导致细胞外基质(ECM)的产生增加，其主要由胶原蛋白和粘附蛋白组成，降解减少，从而可逆性破坏正常肝组织，最终形成肝纤维化。miRNA能够直接参与肝星状细胞的活化和凋亡，促进或抑制肝纤维化的进程，也可以通过调控纤维化相关信号通路间接地促进或抑制肝纤维化的发生发展。

2. miRNA的生物学特性

自1993年Lee等 [1] 首次发现并命名miRNA以来，微小RNA被陆续发现在植物、动物和病毒的基因表达中发挥着重要的作用，miRNAs可参与到生命过程中的一系列重要进程，包括早期胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢，甚至可通过mRNAs途径调节干细胞的分化。

miRNAs (microRNAs，微小RNA)，是一类长度在21~22个核苷酸的小RNA分子，其主要特点是内源性单链非编码的单链小分子RNA，能够通过与靶mRNAs特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后表达的调控 [2]。miRNA存在多种形式，可分为初始miRNA (primiRNA)、miRNA前体(pre-miRNA)和成熟miRNA (mtmiRNA)共3类，miRNA的初级转录物通常由细胞核内的RNA多聚酶II (PolII)转录成pri-miRNA，然后由RNaseIII内切酶Drosha在核内加工成pre-miRNA，并从核内导入胞质，再经RNaseIII内切酶Dicer加工成为单链mt-miRNA [3]，其引导链(成熟miRNA)与RNA诱导沉默复合物(RISC)结合而产生作用。miRNA由一段长度为70~80个核苷酸具有发夹环结构的miRNA前体(premiRNA)剪切后生成 [4]。它通过与其目标mRNA分子的3’端非编码区域(3’UTR)互补导致该mRNA分子的翻译受到抑制。miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，且大部分位于基因间区。它们的转录独立于其他基因，不翻译成蛋白质，但具有调节其他基因表达的能力、活动，然后才能参与到生命过程中一系列重要的过程中。肝脏中含有丰富的miRNA，它们在由各种原因引起的肝脏损伤引起的肝脏感染性疾病中起着重要作用，这其中就包括肝炎、肝纤维化和HCC等肝脏疾病 [5]。除了在肝脏纤维化中表达增高，miRNAs还在肾纤维化 [6]、肺纤维化 [7] 及心肌纤维化 [8] 等进程中的表达增高。

3. miRNA参与HSCs的活化、增殖和凋亡

HSCs的激活是肝纤维化的关键环节，miRNA可以直接参与对HSCs的正向或者逆向的调控，从而影响肝纤维化的发生发展。

有研究显示miR-29b可通过直接与HSCs的I型胶原蛋白基因的3'-UTR和特异性蛋白1基因的3'-UTR结合共同抑制I型胶原表达 [9]。在一项体外研究中，miR-27a和miR-27b的过表达导致HSCs的活化表型逆转为更静止的表型，脂肪积累增加，增殖减少 [10]。miR-27a和miR-27b的作用是通过调节HSCs中类视黄醇X受体来介导的。Zhang Z等 [11] 分别对肝硬化患者和TAA或CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型进行研究，发现miR-21表达升高，下调miR-21和AP-1的表达后，HSC的表达明显受抑制，纤维化程度好转。Yan等 [12] 在HSC后的前3天和10天检测到miR-34a和转录因子ACSL1的表达水平绝对静止，miR-34a沉默后HSC中ACSL1的表达显著高于NC和NT细胞(P < 0.05)，证实miR-34a负向调节ACSL1的表达，进而参与肝纤维化过程。基因微阵列试验后，肝纤维化中miR-150的表达显著降低(P < 0.01)，miR-150在LX-2细胞系中的高表达抑制了细胞增殖，这意味着miR-150正在调节HSC细胞凋亡，抑制肝纤维化中发挥着重要作用 [13]。另外，研究发现miR-29在人和小鼠肝纤维化组织和活化的HSC中显著下调。miR-29类似物导入小鼠后可抑制CCl4诱导的小鼠肝纤维化，并伴有平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原和金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1)的α-下调。miR-29在活化的HSC中过度表达，可通过负性调节细胞周期蛋白D1 (cyclinD1)和P21的表达来阻断G1期的细胞周期，从而抑制细胞生长和分化，抑制HSC的活化和诱导凋亡，最终起到抑制肝纤维化的作用 [14]。

4. miRNA调节肝纤维化相关通路

肝纤维化是不同的病因引起的慢性肝损伤的结果，包括病毒、自身免疫、药物诱导、胆汁淤积和代谢疾病。纤维化的机制受到多个信号通路的调节，主要包括TGF-β信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号及其他相关信号通路。

4.1. miRNA通过TGF-β/Smad信号通路调控肝纤维化

TGF-β是一类多功能蛋白，主要在分子水平上调节细胞的生长和分化。其主要机制是激活Smads蛋白与膜受体结合并进入细胞核，从而调节靶基因的转录并影响肝纤维化的进程。TGF-β/Smad是肝纤维化的主要途径，可抑制正常肝细胞的增殖，刺激HSCs的活化，促进ECM的形成和沉积；该信号通路主要在肝纤维化的炎症和炎症后阶段发挥作用。炎症期Kupffer细胞被激活，大量释放促因子TGF-β1、PDGF、EGF等，刺激活化的HSC转化为肌成纤维细胞；在炎症后阶段，HSC和肌成纤维细胞可分泌TGF-β1、TNF-α等因子，进一步促进自身活化 [15]。在肝纤维化中，Smad蛋白家族中的Smad3和Smad4蛋白可合体转位到细胞核中参与基因的调控，具有促纤维化作用；而Smad2和Smad7可以终止TGF-β的信号转导，具有保护作用 [16]。miR-20a-5p的下调可降低TGF-β2的活性，增强TGF-β信号传导，导致激活的巨噬细胞和HSCs产生ECM，促进肝纤维化的进展；而miR-20a-5p的上调则会抑制细胞因子的释放，抑制肝纤维化 [17]。miR-30主要对TGF-β信号通路靶基因产生阻抑作用，通过抑制HSCs的活性，来阻止肝纤维化的进展 [18]。TGF-β1可诱导miR-33a的表达，同时miR-33a通过靶作用于smad7又可反过来刺激由TGF-β1诱导的HSCs的活化 [19]。

4.2. miRNA通过Wnt信号通路调控肝纤维化

Wnt信号通路也在肝纤维化进程中发挥重要作用，其信号通路成员包括Wnt蛋白、Dishevelled蛋白、特异受体卷曲蛋白、β-联蛋白以及T细胞因子(T cell factor, TCF)转录因子家族等构成。Wnt是一类分泌型糖蛋白，在细胞间有旁分泌和自分泌两种分泌方式。在肝纤维化过程中，主要通过自分泌的方式，由HSCs自分泌的方式释放到细胞外，Wnt通过结合HSCs膜上的相关蛋白调节HSC的活化。Yu F等 [20] 在纤维化肝组织和活化的HSC中观察到miR-378a-3p表达降低。miR-378a-3p的上调抑制HSC活化，包括细胞增殖、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和胶原蛋白表达。此外，miR-378a-3p过表达导致Wnt/β-catenin通路失活。肝脏miR-146a-5p在纤维化脂肪性肝炎中下调，但其靶基因Wnt1和Wnt5a及其随后的效应子α-SMA和Col-1显着上调。此外，与静止的原代HSC相比，激活的原代HSCs中miR-146a-5p下调，而Wnt1和Wnt5a上调。miR-146a-5p在HSCs中的过表达抑制了HSC的活化和增殖，伴随着Wnt1、Wnt5a、α-SMA和Col-1的表达降低。miR-146a-5p通过靶向Wnt1和Wnt5a以及随后的效应子α-SMA和Col-1，在非酒精性纤维化脂肪性肝炎的进程中抑制HSCs的激活和增殖 [21]。

4.3. miRNA通过NF-κB信号通路调控肝纤维化

NF-κB是一类核蛋白因子，由p50、p52、RelA (P65)、RelB和cRel五个成员组成，其形成同源二聚体或异二聚体，是免疫反应、炎症和癌症的关键调节因子。NF-κB通过与NF-κB抑制蛋白结合，使自身处于抑制状态，可通过降解IκBs的方式活化NF-κB，IκBs可被IκBs激酶磷酸化，活化的NF-κB转移到细胞核内与DNA结合，并作为转录因子发挥作用。有研究显示 [22]，当miR-126在肝脏细胞中过表达时，可显著抑制IκBa的表达，激活NF-κB，同时也使其下游信号分子表达增强。然而当miR-126在肝脏细胞中表达受到抑制时，IκBa表达增加，使NF-κB的表达受到抑制，进而促进肝纤维化的发生。miR-378a-3p受Smo依赖性NF-κB信号传导调节，通过直接靶向GLI家族锌指蛋白3 (Gli3)，减少的Gli3和促纤维化基因的表达，抑制HSC的活化 [23]。

4.4. 其他信号途径调控肝纤维化

除上述信号通路外，还有其他信号途径如Hh信号途径、PI3K/AKT通路、PDGFR信号途径等通过不同的方式促进或抑制肝纤维化的发生。在活化的HSCs中，miR-378a-3p的表达水平与Hh信号转导途径中锌指转录因子Gli3的表达呈负相关，miR-378a-3p可通过靶向调节Gli3的活性，影响HSC的增殖活化 [23]。miR-182在肝脏组织的纤维化进程中表达升高，其升高与FOXO1关系密切，当miR-182的表达增强和表达减弱的FOXO1共同通过PI3K/AKT信号通路调节肝纤维化细胞，促进纤维化的发展发生 [24]。有研究显示，miR-26b-5p 过表达影响了一系列与纤维化和血管生成相关的基因，miR-26b-5p负调节PDGFR-β表达并减弱肝纤维化和血管生成，这可能是肝纤维化的有效治疗策略 [25]。

5. 结论

随着不断的研究深入，miRNA在很多疾病的诊断治疗中展示着重要的作用，但是在各种病因导致的肝纤维化中的研究仍在起始阶段。不同的miRNA参与肝纤维化的表达方式不同，也就导致肝纤维化进展方向的不同。越来越多的研究表明miRNA可以用来作为预测、诊断及治疗疾病的标记物，因此，筛选出对肝纤维化进展极具影响的miRNA，了解其作用机制并针对其作用靶点进行基因层面的预防和治疗，将对肝纤维化的临床治疗有着重要意义。