1. 引言
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia, KP)是一种具有荚膜结构的侵袭力较强的革兰阴性杆菌，可引起呼吸道、血液、腹腔及泌尿系统等部位感染。2014~2019年中国耐药监测网(CHINET)统计结果显示肺炎克雷伯菌在所有致病菌的检出率仅次于大肠埃希菌，位居第二，对头孢曲松和头孢噻肟的耐药率分别为31.5%~34.6%、31.6%~39.9%；对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率分别为17.3%~22.4%和13.6%~19.0%；对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为4.8%~10.5%和4.5%~10.9%，均出现了显著的上升 [1]，产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是其主要的多重耐药机制 [2]。ESBLs的主要特点是由质粒介导，以产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为代表菌株 [3]，耐药菌株不仅对β-内酰胺类抗生素呈现耐药，并且对其它类抗生素交叉耐药，特别是产碳青酶烯酶的肺炎克雷伯菌，甚至令临床束手无策，病死率特别高，有报道30 d病死率为41.6% [4]，因此亟需加快新药研发步伐，但是目前高昂的研发成本及较低的研发效率促使科研人员寻求其它的治疗途径。中药在抗菌作用上蕴藏着巨大潜力，不论是单方还是复方制剂在抑制细菌方面都有明显效果，一些医药工作者在对中药抗肺炎克雷伯菌感染的研究工作中筛选发现了一些抗菌有效成分或联合用药方案 [5] [6] [7] [8]。本实验通过测定黄连提取物、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀等中药组分联合硫酸阿米卡星对肺炎克雷伯菌耐药株的体外抗菌作用，为临床用药方案提供数据依据。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料与仪器
硫酸阿米卡星对照品(批号130335-200204)、盐酸小檗碱对照品(批号110713-201212)、盐酸巴马汀(批号110732-201510)均购自中国食品药品检定研究院。黄连药材购自九江开心人大药房，经九江学院刘可越教授鉴定为毛茛科植物黄连Coptischinnsis Franch.的干燥根茎。以95%乙醇，超声功率400 W提取3次，每次15 min，合并三次提取液浓缩至浸膏，冷冻干燥得到黄连提取物。
高频数控超声波提取仪KQ-500TDV (昆山市超声仪器有限公司)，旋转蒸发仪(莱伯泰科EV341)，真空冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)，实验室超纯水设备(重庆摩尔生物技术有限公司)，立式压力蒸汽灭菌器(上海申安)，Phoenix-100全自动微生物鉴定/药敏仪及配套鉴定药敏板条(美国BD公司)、BACTEC FX全自动血培养仪(美国BD公司)、Heal Force生物安全柜(B2级)、−80℃冰箱(海尔DW-86L386)、哥伦比亚血平板(OXOID)、中国兰琼脂及营养肉汤琼脂(杭州滨和)。
2.2. 肺炎克雷伯菌耐药菌株的菌种鉴定、保存、复苏与筛选
肺炎克雷伯菌多重耐药株分离自九江学院附属医院临床感染性标本，菌种的鉴定和常规药物敏感性实验由美国BD Phoenix-100全自动微生物鉴定/药敏仪及配套鉴定药敏板条完成。各项操作均严格按仪器标准操作规程进行。大肠埃希菌标准株(ATCC25922)及肺炎克雷伯菌标准株(ATCC700603)由中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)提供，所有实验菌种均于鉴定和药敏试验完成后保存于−80℃冰箱。除标准菌株ATCC25922外，选择2016~2019年间80株对头孢噻肟最小抑菌浓度MIC > 32 μg/mL的肺炎克雷伯菌，实验前将这些菌株从冰箱取出、复苏，转种于哥伦比亚血平板和中国兰平板，用于体外联合用药筛选研究。
2.3. ESBLs检测方法及参考标准
ESBLs检测参照CLSI M100-S24文件推荐的纸片扩散确证法进行检测。用每片含30 μg头孢他啶、30 μg头孢噻肟和头孢他啶/克拉维酸(30 μg/10 μg)或头孢噻肟/克拉维酸(30 μg/10 μg)的复合纸片进行试验，当任何一种复合纸片抑菌圈直径大于或等于其单独药敏纸片抑菌圈直径5 mm时可确证该菌株产ESBLs。抗生素的敏感(S)、中介(I)、耐药(R)的判断折点及试验方法、质量控制遵循CLSI M100-S30文件：肺炎克雷伯菌对阿米卡星的MIC ≥ 64 μg/mL为耐药，MIC = 32 μg/mL为中介，MIC ≤ 16 μg/mL为敏感 [9]。
2.4. 体外抑菌试验
以肺炎克雷伯菌标准株(ATCC700603)和大肠埃希菌标准株(ATCC25922)为质控菌株，采用微量肉汤稀释法分别测定硫酸阿米卡星、黄连提取物、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀各药物的MIC值，根据单药抑菌试验结果，按照棋盘稀释法进行联合抑菌作用观察，计算部分抑菌浓度(FIC)指数。FIC = MIC甲药联用/MIC甲药单用 + MIC乙药联用/MIC乙药单用，FIC ≤ 0.5为协同作用，0.5 < FIC ≤ 1为相加作用，1 < FIC ≤ 2为无关作用，FIC > 2为拮抗作用 [10]。
3. 结果
3.1. 多重耐药肺炎克雷伯菌筛选结果
从82株对头孢噻肟的MIC > 32 μg/mL的肺炎克雷伯菌中，共筛选出10株对头孢噻肟MIC ≥ 256 μg/mL，头孢他啶MIC > 32 μg/mL，头孢吡肟MIC > 16 μg/mL，氨曲南MIC > 16 μg/mL，同时对阿米卡星呈耐药(5株)、中介(3株)、敏感(2株)的多重耐药肺炎克雷伯菌(编号：164153、164368、166276、171245、175173、177986、186472、187765、191343、193215)，其中177986号对亚胺培南和美罗培南MIC > 8 μg/mL，显示对碳青酶烯类抗生素耐药。
3.2. ESBLs检测结果
上述筛选出的10株肺炎克雷伯菌，经纸片扩散确证法检测均为产ESBLs多重耐药菌株。
3.3. 联合用药试验结果
实验结果表明，黄连提取物、盐酸小檗碱和盐酸巴马汀与阿米卡星联用后，所筛选的10株多重耐药菌对阿米卡星的MIC值出现明显下降，降低了2~4个浓度梯度；而黄连提取物、盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的MIC都降低了2~8个浓度梯度，表现出明显的协同或相加作用(见表1，表2，表3)，显示出非常好的联合用药效果；尤其是盐酸巴马汀与阿米卡星联用后对所测定耐药菌均产生协同作用，且所有菌株对阿米卡星的MIC值降至16 μg/ml及以下，成为敏感菌株(MIC ≤ 16)，显示出非常良好的体外抗菌效果。
Table 1. Antibacterial effect of the extract of Coptis chinensis combined with amikacin on Klebsiella pneumoniae producing ESBLs in vitro
表1. 黄连提取物与阿米卡星联用对产ESBLs酶肺炎克雷伯菌的体外抗菌作用
Table 2. Antibacterial effect of berberine hydrochloride combined with amikacin on Klebsiella pneumoniae producing ESBLs in vitro
表2. 盐酸小檗碱与阿米卡星联用对产ESBLs酶肺炎克雷伯菌的体外抗菌作用
Table 3. Antibacterial effect of palmatine hydrochloride combined with amikacin on Klebsiella pneumoniae producing ESBLs in vitro
表3. 盐酸巴马汀与阿米卡星联用对产ESBLs酶肺炎克雷伯菌的体外抗菌作用
4. 讨论
临床抗生素的大量应用使细菌的抗药性问题日益严重，耐药菌感染频发，产ESBLs肺炎克雷伯菌的检出率及耐药率均逐年升高 [11] [12] [13]，近年来高致病性肺炎克雷伯菌引起致命性的社区获得性感染也备受关注 [14]，如何对肺炎克雷伯菌的耐药性进行控制及治疗成为全球研究的热点和难点。相对于抗生素类药物，中药不易使病原菌产生抗药性，同时某些中药成分又能产生协同抗菌作用，因此中药与抗生素的联合用药既能够有效逆转细菌的耐药性，同时还有可能降低抗生素的用药量，减低临床用药风险，成为一种有效的临床治疗方案 [15] [16]。
氨基糖苷类抗生素对肺炎克雷伯菌的临床治疗效果较好，但随着产ESBLs肺炎克雷伯菌的增加，其耐药性逐步升高，治疗效果也在逐渐降低 [17] [18]。黄连作为传统的中药材，具有抗菌、排毒等药理作用，常用于治疗大肠埃希菌导致的胃肠道感染，它主要含有小檗碱、黄连碱、巴马汀等生物碱。有体外实验也表明，黄连提取物对大肠埃希菌有着一定的抑菌作用 [19] [20]，本研究组也曾报道过黄连成分与阿米卡星联合用药对多重耐药大肠埃希菌有明显协同或相加作用 [21]，效果良好。本研究表明黄连提取物、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀三种中药成分单独使用时，对多重耐药肺炎克雷伯菌的MIC ≥ 512 μg/ml，虽然也有一定的作用，但抗菌活性并不强；但三种成分分别与硫酸阿米卡星联合用药后，对多重耐药肺炎克雷伯菌显示了非常好的联合用药效果，能产生明显的协同或相加作用，尤其是盐酸巴马汀与阿米卡星联用的作用效果最佳。5株已对阿米卡星(单药)表现为耐药的肺炎克雷伯菌，在阿米卡星与巴马汀联用后对阿米卡星的MIC值降至16 μg/ml及以下，表现为敏感，显示了非常好的联合用药效果和临床应用前景。
令人惊喜的是，本研究中177986号为耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)，盐酸巴马汀与阿米卡星联合用药后显示了出人意料的效果，不仅产生了协同作用，并且将其由耐药菌转变为敏感菌，这种联合用药是否对其他CRKP同样具有逆转作用，需要进一步的实验数据支持。
基金项目
江西省自然科学基金项目(编号：20192BAB205106)，江西省2020年大学生创新创业训练计划项目(编号：S202011843028)。
NOTES
*通讯作者。