1. 引言
生长抑素又称生长激素释放抑制激素，是一种人体内自然合成的、由14个氨基酸组成的环状肽类化合物 [1] [2]。生长抑素具有广泛的生物学活性，生长抑素及其类似物已被证明能在静脉曲张出血中诱导止血 [3] [4] [5]，联合用药治疗重症急性胰腺炎 [6] - [13]。生长抑素抑制血管舒张激素(如胰高血糖素)的释放，间接导致内脏血管收缩和门静脉血流减少。它的半衰期很短，在注射后几分钟内消失。生长抑素对多种胃肠功能有着显著的抑制作用，包括胃酸、胃泌素和胃蛋白酶的分泌。目前，《中国药典》收载的生长抑素有关物质的检测方法是以磷酸溶液(取磷酸11 mL，加水800 mL，用三乙胺调节pH值至2.3，用水稀释至1000 mL)为流动相A，以乙腈为流动相B的梯度洗脱 [14]。该方法未对生长抑素的特定杂质有效地分离。关于生长抑素含量、醋酸、有关物质检测的文献很多，但未见生长抑素氧化杂质及Di-Gly2-生长抑素、Des-Gly2-生长抑素检测的方法 [15] - [20]。生长抑素强制降解实验中，经双氧水氧化得到的杂质为氧化杂质，分别为氧化杂质1 (序列：Ala-Gly-Cys(SO3H)-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH)、氧化杂质2 (序列：Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(SO3H)-OH)；Di-Gly2-生长抑素(序列：Ala-Gly-Gly-c(Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys)-OH)为起始物料保护甘氨酸引入的杂质，Des-Gly2-生长抑素(序列：Ala-c(Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys)-OH)为工艺杂质。为了更好地测定生长抑素中A、B、C、D，建立了HPLC测定生长抑素中以上4种特定杂质的新方法。该方法对比了外标法和自身对照法测定4种特定杂质，结果自身对照法与外标法无显著性差异，自身对照法操作简单、专属性强、灵敏度高，可满足生长抑素中氧化杂质1、氧化杂质2、Di-Gly2-生长抑素、Des-Gly2-生长抑素4种特定杂质的测定要求。
2. 仪器与试药
2.1. 仪器
Thermo高效液相色谱仪(Ultimate 3000)；Mettler Toledo电子天平(十万分之一，MS205DU)。
2.2. 试药
生长抑素对照品(批号：140711-202006；质量分数：86.25%；中国食品药品检定研究院)；注射用生长抑素(原研对照药，思他宁，Merck Serono SA Succursaled’Aubonne)；生长抑素氧化杂质1对照品(批号200301；质量分数97.99%；山东新时代药业有限公司)；生长抑素氧化杂质2对照品(批号200301；质量分数82.97%；山东新时代药业有限公司)；Di-Gly2-生长抑素对照品(批号200301；质量分数95.53%；山东新时代药业有限公司)；Des-Gly2-生长抑素对照品：(批号200401；质量分数92.18%；山东新时代药业有限公司)；生长抑素(批号200601；质量分数99.8%；山东新时代药业有限公司)；乙腈(色谱纯，Merck)；六氟磷酸钾(分析纯，TCI)；磷酸氢二铵(分析纯，西陇科学)；磷酸(分析纯，国药集团)；水(纯化水，自制)。
3. 方法与结果
3.1. 色谱条件
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB-C18，4.6 mm × 250 mm，3.5 μm)；以乙腈为流动相A，以0.05 mol∙L−1六氟磷酸钾，0.02 mol∙L−1磷酸氢二铵水溶液(pH3.5)为流动相B；流速为1.0 mL∙min−1；检测波长为220 nm；柱温为30℃；进样体积15 μL；按下表1进行梯度洗脱。
3.2. 方法学考察
3.2.1. 专属性试验
分别称取各杂质对照品适量，用水溶解并稀释制成每1 mL分别含生长抑素氧化破坏杂质1、生长抑素氧化破坏杂质2、Des-Gly2-生长抑素各5μg、Di-Gly2-生长抑素2μg的溶液，作为定位溶液。取生长抑素原料药适量，精密称定，加水溶解并稀释制成每1mL中约含1mg的溶液，作为供试品溶液。称取生长抑素原料药及各杂质对照品适量，加水溶解并稀释制成每1mL中含生长抑素1mg，生长抑素氧化破坏杂质1、生长抑素氧化破坏杂质2、Des-Gly2-生长抑素各5μg、Di-Gly2-生长抑素2μg的溶液，作为混合溶液。分别取空白溶剂、各杂质定位溶液、供试品溶液及混合溶液，进样，记录色谱图。空白溶剂对生长抑素4种杂质测定无干扰，专属性良好。见图1。
3.2.2. 系统适用性试验
分别取生长抑素原料药及Di-Gly2-生长抑素对照品和Des-Gly2-生长抑素对照品各适量，加水溶解并稀释制成每1 mL中约含生长抑素1 mg、Di-Gly2-生长抑素2 μg和Des-Gly2-生长抑素5 μg的溶液，作为系统适用性溶液。取系统适用性溶液，连续进样6次，记录色谱图。Di-Gly2-生长抑素、生长抑素、Des-Gly2-生长抑素色谱峰保留时间的RSD分别为0.12%、0.12%、0.11%，Di-Gly2-生长抑素、生长抑素、Des-Gly2-生长抑素色谱峰峰面积的RSD分别为0.39%、0.25%、0.37%，生长抑素与Di-Gly2-生长抑素、Des-Gly2-生长抑素的分离度分别为1.68、2.52，分离度良好，系统适用性符合要求。
Figure 1. HPLC chromatograms. A. blank solution; B. sample solution; C. mixed reference substance solution; 1. Oxidationdestroys impurity 1; 2. Oxidationdestroys impurity 2; 3. Di-Gly2-somatostation; 4. Somatostation; 5. Des-Gly2-soma- tostation
图1. HPLC图谱。A. 空白溶液；B. 供试品溶液；C. 混合对照品溶液；1. 氧化杂质1；2. 氧化杂质2；3. Di-Gly2-生长抑素；4. 生长抑素；5. Des-Gly2-生长抑素
3.2.3. 精密度试验
1) 外标法
分别称取Des-Gly2-生长抑素10.51 mg、生长抑素氧化破坏杂质1 10.04 mg、生长抑素氧化破坏杂质2 10.15 mg、Di-Gly2-生长抑素10.38 mg，分别置50 mL的量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；分别量取Des-Gly2-生长抑素、生长抑素氧化破坏杂质1、生长抑素氧化破坏杂质2储备液各0.5 mL，Di-Gly2-生长抑素储备液0.2 mL置10 mL量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
取生长抑素(批号504200601) 10 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，分别量取Des-Gly2-生长抑素、生长抑素氧化破坏杂质1、生长抑素氧化破坏杂质2储备液各0.5 mL，Di-Gly2-生长抑素储备液0.2 mL，加稀释液稀释至刻度，摇匀，作为加标重复性溶液，平行配制6份，取加标供试品溶液和对照溶液，按照3.1项下色谱条件测定，记录色谱图，以外标法计算氧化破坏杂质1、氧化破坏杂质2、Di-Gly2-生长抑素、Des-Gly2-生长抑素的含量，并计算结果的RSD。结果破坏杂质1、氧化破坏杂质2、Di-Gly2-生长抑素、Des-Gly2-生长抑素的RSD分别为0.89%、1.03%、3.36%、0.52%，表明该方法重复性良好。
不同日期，由另一名分析员，使用另一台HPLC仪器，按照重复性试验项下的制备方法，平行制备加标供试品溶液6份，作为中间精密度溶液，按照3.1项下色谱条件测定，记录色谱图。取中间精密度和重复性项下12份样品中氧化破坏杂质1、氧化破坏杂质2、Di-Gly2-生长抑素、Des-Gly2-生长抑素的计算结果，求此4个杂质12份结果的RSD值，结果显示氧化破坏杂质1、氧化破坏杂质2、Di-Gly2-生长抑素、Des-Gly2-生长抑素的RSD分别为3.69%、2.29%、4.82%、2.48%，表明该方法精密度良好。
2) 自身对照法
分别精密量取2.2.3外标法中重复性溶液和中间精密度溶液中的加标供试品溶液1.0 mL至50 mL量瓶中，加水稀释定容至刻度，平行制备6份重复性−2%自身对照溶液和6份中间精密度−2%自身对照溶液，按“3.1”项下色谱条件进样测定；按“3.1”项下色谱条件进样测定；计算中间精密度与重复性共12针的自身对照法RSD。结果显示氧化破坏杂质1、氧化破坏杂质2、Di-Gly2-生长抑素、Des-Gly2-生长抑素的RSD分别为3.73%、3.64%、4.44%、3.32%，表明该方法精密度良好。外标法及自身对照法结果对比见表2。
Table 2. Comparison table of results of external standard method and self-compare method of precision test
表2. 精密度试验外标法及自身对照法结果对比表
由结果可知，外标法与自身对照法测定结果无显著性差异。
3.2.4. 定量限(LOQ)与检测限(LOD)
精密称取生长抑素对照品及各杂质对照品适量，采用逐步稀释法，以S/N ≈ 10时的浓度作为定量限浓度；以S/N ≈ 3时的浓度作为检测限浓度。结果见表3。
3.2.5. 线性与范围
在预先设定的定量限浓度~杂质限度的200%浓度范围内，分别配制8份不同浓度的线性系列溶液，记录色谱图。以浓度(X, mg·mL−1)为横坐标，峰面积(Y, AU)为纵坐标，绘制标准曲线。各杂质及生长抑素主成分在浓度范围内呈显著的线性关系。结果见表3。
Table 3. The linearity, ranges, regression equations and LOQ、LOD result
表3. 线性与范围、回归方程和定量限、检测限结果
3.2.6. 回收率试验
取生长抑素原料药，分别加入3个不同浓度的各杂质对照品溶液，每个浓度平行配制3份，依法测定，计算各杂质回收率。回收率具体结果见表4。
Table 4. The results of recovery test (n = 9)
表4. 回收率试验结果(n = 9)
由结果可知，本法准确度较高。
3.2.7. 耐用性试验
取对照溶液、供试品溶液，通过改变流速(0.95 mL/min, 1.05 mL/min)、流动相A的pH (pH = 2.2, pH = 2.4)、改变柱温(28℃, 32℃)、更换不同批号的色谱柱，依法检测，考察方法的耐用性，结果见表5。
Table 5. The results of serviceability test
表5. 耐用性试验结果
由结果可知，当改变柱温、色谱柱、流动相pH、流速，测得的各杂质的含量的RSD均符合要求，本法耐用性较好。
3.2.8. 样品检测
取生长抑素自制三批样品(批号504200501、504200601、504200602)及注射用生长抑素(原研对照药，思他宁，Merck Serono SA Succursaled’ Aubonne)三批，依法检测。按照自身对照法计算，结果显示，三批样品检测结果质量优于原研制剂。具体结果见表6。
Table 6. Determination results of sample
表6. 样品检测结果
4. 结论
4.1. 色谱条件的优化
本方法以中国药典2020版生长抑素有关物质测定方法中的色谱条件为基础，流动相A从磷酸溶液(取磷酸11 mL，加水800 mL，用三乙胺调节pH值至2.3，用水稀释至1000 mL)-乙腈体系调整为0.05 mol·L−1六氟磷酸钾(pH2.3)的流动相体系。该色谱条件下，Des-Gly2-生长抑素与生长抑素峰可完全分离，但Di-Gly2-生长抑素与生长抑素峰分离较差。继续将流动相A从0.05 mol·L−1六氟磷酸钾(pH2.3)调整为0.05 mol·L−1六氟磷酸钾 + 0.02 mol·L−1磷酸氢二铵(pH3.5)，该色谱条件下，Di-Gly2-生长抑素和Des-Gly2-生长抑素均能与生长抑素峰有良好的分离。
4.2. 外标法与自身对照法对比
本实验中主要采用了外标法对生长抑素4种特定杂质进行了方法学验证，在精密度试验中外标法和自身对照法进行了对比，从结果可以看出，外标法和自身对照法均可以较准确地测定生长抑素中各杂质的含量，外标法和自身对照法测定结果无明显差异。因外标法需用到杂质对照品，杂质对照品难获得，而自身对照法采用将供试品溶液稀释成与杂质相当的溶液，作为对照溶液，测得的供试品溶液色谱图中各杂质的峰面积与对照溶液主成分的峰面积的比值，即为杂质的含量，不需杂质对照品，操作简单，因此，可用自身对照法对生长抑素中4种特定杂质进行检测。
4.3. 小结
本研究建立了自身对照法检测生长抑素中的4种特定杂质的方法。本方法简单，灵敏，专属，准确，适用于生长抑素有关物质的放行检测和稳定性考察。同时为多肽药物杂质谱研究提供了依据。
基金项目
山东省重大科技创新工程项目(2019JZZY010516)，多肽药物的高效绿色合成技术的研发及规模化应用。
参考文献
NOTES
*通讯作者。