1. 引言
尿酸(Uric acid)是嘌呤(purine)经由肝脏代谢后的终产物。血清中尿酸来源80%是由体内胺基酸、核酸等分解而来，而20%是由含普林或核蛋白食物代谢而来。每天人体制造的尿酸约有750 mg，绝大多数由肾脏排出体外。体内尿酸产生过多或肾脏排泄尿酸不良，使血中尿酸浓度高于可溶性饱和点时，就称为高尿酸血症。当男性每100 mL血液中的尿酸值在7 mg以上，女性在6 mg以上时，便称为高尿酸血症。
尿酸是一种弱酸，在人体生理的酸碱值下，是以离子化形式–尿酸盐(urate)存在。当1) 人体摄取富含嘌呤或导致嘌呤合成增加的食物；2) 尿酸的合成增加；3) 排泄出体外的尿酸量减少，皆会引起高尿酸血症。尿酸浓度增加时，尿酸分解并产生自由基，导致氧化压力上升、发炎及第二型血管张力素分泌 [1]，因此高尿酸血症与心血管疾病、糖尿病、肾脏病功能异常、高血压等有关 [2]。因此，有必要降低血液中尿酸值来防止高尿酸血症相关疾病。
目前降低血液中尿酸的药物可分为两类，一类为包含黄嘌呤氧化酶抑制剂(Allopurinol、febuxostat)另一类为促尿酸排泄剂(Benzbromarone、probenecid、sulfinpyrazone)等。然而，降尿酸药物都有可能产生副作用 [3] [4]，因此需要开发降低尿酸的替代治疗策略。
益生菌是活的微生物，对宿主的健康产生有益的影响，具有抗氧化、抗发炎及减少肠胃道疾病等功效，而近期研究指出，益生菌也会参与宿主的能量代谢，使益生菌具有抗肥胖、降血糖的效果。因此本研究利用体外模式，筛选出对于嘌呤具有最佳降解能力之菌株，再利用高尿酸血症的动物模式，评估益生菌对于降低血液中尿酸的功效。
2. 材料与方法
2.1. 降尿酸益生菌株体外筛选
欲筛选之益生菌株培养于MRS培养基中，经37℃、16小时培养，以4200 rpm离心10分钟，去掉上清液取得菌体，将菌体回溶于含1.25 mM inosine及1.25 mM guanosine之PBS溶液中，于120 rpm、37℃下震荡培养2小时。培养完成后以4200 rpm离心10分钟，取得上清液，利用HPLC分析上清液中残留inosine及guanosine浓度，选出最具有降尿酸潜力之菌株(Lactobacillus reuteri GKR1)进行动物试验。
2.2. 动物试验菌株菌粉制备
罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri GKR1培养于5 L MRS培养基中，经37℃、16小时培养，以4200 rpm 离心10分钟，去掉上清液取得菌泥，混入20%脱脂奶粉后冷冻干燥而得。
2.3. 试验动物分组
ICR雄鼠40只，每只体重约20~25 g，购自乐斯科生物科技(台湾，台北)。适应环境1周后，将小鼠随机分为5组，每组8只小鼠，分别为正常对照组、负对照组、阳性对照组、低剂量GKR1组及高剂量GKR1组，饲养温度维持于22℃ ± 3℃，相对湿度55% ± 15%，定时12小时之光暗周期，IACUC编号为：108-14h。
2.4. 试验设计与喂食剂量
试验期间，正常对照组每天给予MFG饲料，负对照组、阳性对照组、低剂量GKR1组及高剂量GKR1组每天给予制作成固态饲料的LabDiet 5001粉状饲料添加potassium oxonate 2.5%及RNA 1%，使小鼠造症为高尿酸血症。试验时间为14日，每日由研究人员秤取阳性对照组与GKR1，以逆渗透水配置，限当天使用。不同剂量之GKR1各有不同的人体建议剂量，分别为成人每日服用0.05、0.1 g的GKR1，投予剂量之换算公式为每位成人每日服用剂量 ÷ 60 kg (成人平均体重) × 12.3 (小鼠与人的换算系数)，换算下GKR1低、高剂量分别为10.25、20.5 mg/kg BW。使用喂食针将负对照组物质逆渗透水、阳性对照组物质Allopurinol (0.5 mg/kg BW)以及GKR1分别管喂投予各组试验小鼠。每只小鼠投予体积为10 mL/kg BW。
2.5. 检测项目
2.5.1. 体重测定
试验动物于投予试验物质前，试验期间每周量测1次体重。
2.5.2. 摄食量
试验期间每周进行结算1次，量测方法为每周固定时间加入定量饲料，1周后结算剩余饲料量，计算动物摄食量。
2.5.3. 血中尿酸(Uric Acid, UA)、尿素氮(BUN)、肌酸酐(Creatinine)检测
于第7天及第14天时，以颊窝采血方式采及小鼠血液后，将全血于室温静置30分钟，待血清分离后，以10,000 rpm，4℃ ± 1℃环境下，离心10分钟，取上清液即为血清，并保存于−20℃ ± 1℃，待日后分析。
2.5.4. 黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase)活性分析
以二氧化碳牺牲小鼠，取出肝脏进行均质，将肝脏组织与缓冲溶液以1:4混合，以6800 rpm，15秒条件下，取肝脏均质液分析黄嘌呤氧化酶酵素活性(Xanthine Oxidase Assay Kit, Biovision)。
2.6. 统计分析
实验数据以平均值(mean)及标准偏差(standard deviation, SD)表示。试验数据利用SPSS统计软件中单因子变异数分析(One-Way ANOVA)后以Duncan’s multiple range test分析各组间数据之差异性，并以p值小于0.05作为显着差异水平。
3. 结果
3.1. 最佳嘌呤降解能力菌株
11种益生菌株进行嘌呤降解筛选，多数益生菌株降解环境中inosine及guanosine不超过30%，而L. reuteri GKR1可完全降解inosine及guanosine能力达100% (图1)，因此后续使用L. reuteri GKR1进行动物试验。
Figure 1. Purine decomposing ability in each probiotics strain
图1. 各益生菌株降解嘌呤能力
3.2. 体重与摄食量
第0、7、14天小鼠体重，进行各组组间比较，皆无显着差异，结果如表1所示。各组小鼠组间摄食量无明显异常状况，如表2所示。
Table 1. Average body weight of mice in each groups
表1. 试验期间每组小鼠平均体重
所有数据均以Mean ± S.D.表示，以英文字母表示统计之结果，相同字母表示组间不具统计上差异，不同字母表示组间具有统计上差异(p < 0.05)。
Table 2. Average food intake of mice in each groups
表2. 试验期间每组小鼠平均摄食量
3.3. 血清中尿酸、尿素氮、肌肝酸浓度
3.3.1. 尿酸(UA)
试验第7天，负对照组显着高于正常对照组(p < 0.05)，阳性对照组与GKR1低、高剂量组皆显着低于负对照组(p < 0.05) (表3)。试验第14天，负对照组显着高于正常对照组(p < 0.05)；与负对照组相比，阳性对照组、GKR1低、高剂量组皆无显着差异(表4)。
3.3.2. 尿素氮(BUN)
试验第7天及第14天，与正常对照组相比，负对照组、阳性对照组显着增加(p < 0.05)。与负对照组相比，GKR1低、高剂量组组皆显着降低(p < 0.05) (表3、表4)。
3.3.3. 肌肝酸(Creatinine)
试验第7天，正常对照组相比负对照组、阳性对照组及GKR1低、高剂量组显着增加(p < 0.05) (表3)。试验第14天，所有组别均无显着差异(表4)。
Table 3. Serum biochemical parameters of mice in each group at day 7
表3. 各组小鼠第7天之血清生化分析
所有数据均以Mean ± S.D.表示，以英文字母表示统计之结果，相同字母表示组间不具统计上差异，不同字母表示组间具有统计上差异(p < 0.05)。
Table 4. Serum biochemical parameters of mice in each group at day 14
表4. 各组小鼠第14天之血清生化分析
所有数据均以Mean ± S.D.表示，以英文字母表示统计之结果，相同字母表示组间不具统计上差异，不同字母表示组间具有统计上差异(p < 0.05)。
3.4. 肝脏中黄嘌呤氧化酶活性检测
试验第14天，正常对照组、负对照组与阳性对照组之间无显着差异。与负对照组相比，GKR1高剂量组显着降低(p < 0.05) (图2)。
所有数据均以Mean ± S.D.表示，以英文字母表示统计之结果，相同字母表示组间不具统计上差异，不同字母表示组间具有统计上差异(p < 0.05)。
Figure 2. Liver xanthine oxidase activity of mice in each group at day 14
图2. 各组小鼠第14天之肝脏中黄嘌呤氧化酶活性分析
4. 讨论
近年来，高尿酸血症之盛行率持续增加中，尤其是在西方高收入国家和经济发展中国家，尽管患病率受遗传的影响，但饮酒和饮食因素仍是患病之重要因素 [5] [6]。尿酸为人体蛋白质及嘌呤代谢的终产物，一些高嘌呤食物，如啤酒、海鲜、豆制品、肉类等，会导致体内产生高尿酸 [7] [8]。因此，我们利用体外试验筛选益生菌株，发现L. reuteri GKR1在本试验模式中可完全降解嘌呤，根据Yamada等人 [9] 研究指出，加氏乳杆菌PA-3具有直接利用嘌呤成长之能力，推测L. reuteri GKR1可能也具有相同的能力。后续动物试验中，我们在小鼠饮食中，加入含有高嘌呤的RNA以及potassium oxonate (尿酸酶抑制剂)，诱导小鼠提高血清尿酸浓度，在血清尿酸结果中(表3、表4)，负对照组皆显着高于正常对照组，显示此实验以高嘌呤饮食诱导小鼠高尿酸血症模式造症成功。
在试验第7天，低、高剂量GKR1组血清中尿酸浓度皆显着低于负对照组(p < 0.05) (表3)，试验第14天，低、高种剂量GKR1组，与负对照组相比，虽无统计上的差异，但皆有下降的趋势。推测L. reuteri GKR1具有降尿酸效果，是由于饮食中多余的嘌呤被菌体吸收，减少嘌呤被生物体代谢的机会，达到减少血清中尿酸的效果 [10] [11]。研究指出，高尿酸血症小鼠中，肠道菌群失调并且肠道屏障会受损 [12]，使得肠道中内毒素容易通过肠黏膜进入血液中，造成肾脏的损伤，使得血清内尿素氮含量增加 [13]。于试验第7天及14天，低、高剂量GKR1组血清中BUN浓度皆显着低于负对照组(p < 0.05) (表3、表4)，显示补充GKR1可降低因高尿酸带来的肾脏损伤。血清中Creatinine结果，试验第7天正对照组Creatinine显着高于其他组别，第14天所有试验组均无显着差异(表3、表4)，而根据Serfilippi等人 [14] 研究指出，ICR小鼠之Creatinine正常值介于0.2~0.4 mg/dL，虽试验第7天正对照组Creatinine数值为0.37 mg/dL，还是介于正常值中。
Dolati [15] 等人研究指出，使用potassium oxonate诱导小鼠产生高尿酸血症，其肝脏中黄嘌呤氧化酶会增加，本试验与上述研究具有一致性，黄嘌呤氧化酶为嘌呤代谢为尿酸的关键酵素，其活性增加，会使得更多的嘌呤代谢为尿酸，导致高尿酸血症。试验第14天，高剂量GKR1组，与负对照组相比，显着减少黄嘌呤氧化酶活性(p < 0.05) (图1)，且低于降尿酸药物Allopurinol，显示服用GKR1可帮助降低肝脏中黄嘌呤氧化酶活性。
5. 结论
本试验以体外试验筛选出具有高降解嘌呤能力之GKR1菌株，后以高尿酸血症小鼠，投予GKR1低、高剂量，皆可降低血清中尿酸，也可显着减少血清中BUN含量，减少高尿酸带来的肾脏损伤，而GKR1高剂量可显着降低肝脏中黄嘌呤氧化酶活性，减少体内嘌呤转化为尿酸。综合以上结果，喂食小鼠中剂量L. reuteri GKR1，换算成人剂量为每日服用0.1 g，即对于降尿酸具有效果，且与降尿酸药物Allopurinol效果差异不大，而益生菌可安全食用，相较药物极少有副作用，未来具有进一步开发为降尿酸保健产品之潜力。
NOTES
*通讯作者。