1. 引言
利用1974年首次发现的表面增强拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Scattering，简称SERS) [1] 技术可以大大增强拉曼光谱的灵敏度，拉曼散射强度会增加10−4~10−6倍 [2]。近年来，随着非线性光学的发展及仪器技术的进步，SERS被广泛应用于电化学 [3] [4]、环境分析 [5]、农业生产 [6] [7]、生物医学 [8] [9]、金属工艺 [10] [11] 等领域。其中，SERS检测因其操作简单、对检测物无损、检测无需预处理等优点在农业生产和环境监测领域的应用具有很大的研究价值。
银纳米颗粒(Ag NPs)能有效改善单金属纳米颗粒的物理化学和光电学性质，其共振发生在电磁光谱的可见光和红外(IR)范围内，对表面增强拉曼散射(SERS)信号效果显著，可用于制作高性能SERS活性基底物 [12]。
在实际应用中，通常需要在粗糙、弯曲或非平面的表面采集分析物。而传统的SERS基底为刚性底物，在检测过程中存在难以贴近分析物的情况，需使用合适的溶剂对其进行额外的提取，使检测过程复杂化 [13]。此外，目前的SERS基底大多是含氧降解塑料，检测后的基底通过简单的处理，变为碎片或微塑料后，最终送到垃圾填埋场，为环境带来污染。由于微塑料在环境中具有持久性，难以被分解，并且对生物造成不可逆的伤害 [14]，因此，开发环保且具有柔性的SERS衬底，是当前的研究热点之一。
细菌纳米纤维素(Bacterial nanocellulose，简称BNC)，是由木醋杆菌利用营养物质发酵合成具有三维多孔性质的天然纤维素，发酵使用的营养物质为可再生资源，甚至可以利用工农业废弃物作为其发酵营养物，减轻工农业废弃物对环境的污染。具有高灵活性、 高孔隙率、高纯度和低生产成本的优点 [15]。此外，BNC还具有生物降解性和生物相容性的特点 [16]，为开发环保且具有柔性的SERS衬底提供了一种新的研究方向。
Attasith Parnsubsakul等采用培养木醋酸杆菌使其生成细菌纳米纤维素、对生成的薄膜进行纯化，再使用真空过滤的方法制备纳米银–细菌纤维素柔性膜(nano-silver-bacterial nanocellulose flexible films，简称Ag NP-BNCPs) [17]。但制备细菌纳米纤维素，并使用真空过滤法生成Ag NP-BNCPs的方法存在实验时间较长、操作较为复杂的情况。我们对其实验方案进行改进：直接将制备好的细菌纳米纤维素与银纳米颗粒溶液搅拌，形成混合胶状物，将混合胶状物干燥制备成Ag NP-BNCPs。
研究结果表明，福美双和罗丹明6G (简称R6G)的SERS信号均随着银纳米浓度的增加而增强，且制备的Ag NP-BNCs具有很大的柔韧性。细菌纳米纤维素在开发柔性SERS衬底方向具有广泛的前景。
2. 实验
2.1. 实验试剂与仪器设备
实验试剂：柠檬酸钠(C6H5Na3O7，1%，阿拉丁)，二硫化四甲基秋兰姆(C6H12N2S4, 97%, MACKLIN)，硝酸银(AgNO3，纯度99.8%，国药集团)，罗丹明6G (C28H31ClN2O3)，细菌纳米纤维素(BNC，含量0.8%，桂林奇宏科技有限公司)。
实验仪器设备：集热式磁力搅拌器(上海力辰邦西，DF-101S)；台式高速离心机(科析仪器，TG16G)；超声波清洗机(苏州迈弘，F-020S)；真空干燥器(浙江台州藤原，PC-3)；显微共焦激光拉曼光谱仪(Renishaw, inVia)。
本实验所使用的玻璃器皿均用超纯水及乙醇进行超声清洗。
2.2. 制备Ag NP-BNCPs
2.2.1. 化学法制备银纳米颗粒(Ag NPs)
本实验利用柠檬酸钠还原AgNO3中的银离子,生成的Ag NPs均匀分布在溶质中，形成Ag NPs胶体 [18]，此方法操作简单易行，且对实验设备的要求较低，具体实验操作如下：
锥形瓶中加入300 mL 0.0018%硝酸银水溶液及小磁子，将锥形瓶放入水浴的集热式磁力搅拌器中，通过夹子将锥形瓶固定于水中，使磁力搅拌器中的水位高于锥形瓶内液体的高度，并用培养皿盖住锥形瓶瓶口，使反应溶液受热均匀。将集热式磁力搅拌器的磁力挡位调到50，即转速为2150 rad/min，加热至100℃后，快速将提前超声好的4 mL 1%的柠檬酸钠溶液注入锥形瓶中，溶液由无色迅速变为黄色，继续加热反应60 min，溶液颜色由黄色逐渐变成茶褐色，制得Ag NPs胶体，冷却至室温后避光存放。
2.2.2. 制备Ag NP-BNCPs
由于纳米颗粒易于团聚，会给SERS的检测带来稳定性差、重现性差等问题。上述制备的Ag NPs胶体中银纳米颗粒的浓度较低，故我们先对Ag NPs胶体进行离心，通过取沉淀物并超声的方法提高Ag NPs浓度，再将其与细菌纳米纤维素充分搅拌，使得Ag NPs分散镶嵌于细菌纳米纤维素的孔隙中，从而形成了较为致密的“热点”，有效改善了纳米颗粒易团聚的问题，提高SERS检测的稳定性与重现性。
1) 对Ag NPs胶体进行离心
200 mL的Ag NPs胶体分别加入4支容量为50 mL的离心管中，将离心管置于高速离心机，调节转子号为5、转速1480 rad/min，对Ag NPs胶体进行离心，离心时间为10 min。使用滴管缓慢地将离心管中的上清液吸出，每支离心管剩余5 mL沉淀物。将所有沉淀物集中到同一离心管中，密封后放入超声波清洗机超声15 min，使Ag NPs均匀分散于溶液中。
2) 制备纳米银–细菌纳米纤维素混合胶状物
小烧杯中加入10 mL细菌纤维素，加入1.0 mL的Ag NPs，搅拌30 min。重复上述步骤，细菌纳米纤维素固定取10 mL不变，制备Ag NPs含量不同的混合胶状物。Ag NPs的含量分别取值为1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL。将制备好的混合胶状物密封避光存放。
3) 将纳米银–细菌纳米纤维素混合胶状物干燥制备柔性膜
载玻片用超纯水及乙醇进行超声清洗。将洗净后的载玻片摆放在洁净台上，并用洗耳球将载玻片正表面吹干。
使用量程为1000~5000 μL的移液枪分别取1 mL的Ag NPs的含量为1.0 mL纳米银–细菌纤维素混合胶状物，缓慢地滴在载玻片左右两侧，确保同一载玻片上纳米银–细菌纤维素混合胶状物的体积相同。将载玻片置于真空干燥器干燥，即可制备Ag NP-BNCPs (以下简称柔性膜)。重复上述步骤，分别制备Ag NPs的含量为1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL的柔性膜。
2.3. 检测柔性膜的SERS特性
拉曼光谱采集范围为300~1700 cm−1，激发波长为785 nm，激光功率为1% (即0.5 mw)，积分时间1 s。使用量程为20~200 μL的移液枪，取40 μL 10−4 mM的福美双溶液，滴加至柔性膜上，使溶液充分覆盖柔性膜；另一份柔性膜使用相同的方法滴加40 μL 10−1 mM的罗丹明6G溶液，待溶液自然风干后对其进行拉曼光谱表征。
3. 实验结果与讨论
1) 柔性膜的实物图
图1为银纳米颗粒–细菌纳米纤维素柔性膜实物图，(a)为载玻片上的柔性膜；(b)为弯曲状态的柔性膜；
由图可以看出，制备的柔性膜易与载玻片分离，且柔性很好，可以多角度弯曲。
Figure 1. Image of nano-silver-bacterial nanocellulose flexible films. (a) On the slide; (b) In a curved state
图1. 银纳米颗粒–细菌纳米纤维素柔性膜实物图。(a) 载玻片上；(b) 弯曲状态
2) 待分析物质的确认及其峰位归属
图2、图3分别为不同浓度纳米银–细菌纤维素柔性膜在罗丹明6G、福美双两种SERS分子探针的表面增强拉曼信号图。
Figure 2. Raman spectra of nano-silver-bacterial nanocellulose flexible films in R6G as SERS molecular probe
图2. 纳米银–细菌纤维素柔性膜在罗丹明6G作为SERS分子探针时的拉曼光谱
Figure 3. Raman spectra of nano-silver-bacterial nanocellulose flexible films in thiram as SERS molecular probe
图3. 纳米银–细菌纤维素柔性膜在福美双作为SERS分子探针时的拉曼光谱
由图2可以观察到，在1184、1362、1509 cm−1明显出现罗丹明6G的特征峰，这与杨光轩等 [19] 的研究相似，证明所增强的拉曼信号是属于罗丹明6G的。其中，最强特征峰1509 cm−1是由氧杂蒽环的伸缩振动引起的；1362 cm−1处的特征峰对应于氧杂蒽环的伸缩振动；1184 cm−1处的特征峰对应于C-H弯曲振动。
由图3可以观察到，在1379、1438、1505 cm−1明显出现福美双的特征峰，这与WANG等 [20] 的研究相似，证明所增强的拉曼信号来自于福美双。其中，最强特征峰1379 cm−1是由CH3对称摇摆和C-N伸缩引起的；1438 cm−1处的特征峰对应于C-N伸缩；1505 cm−1处的特征峰对应于CH3对称摇摆和C-N伸缩。
3) 柔性膜中银纳米颗粒的浓度对衬底SERS活性的影响
通过对比银纳米颗粒浓度不同条件下柔性膜在罗丹明6G、福美双两种SERS分子探针的表面增强拉曼信号图(图2、图3)，可明显观察出，在没有加入纳米银–细菌纤维素柔性膜时，罗丹明6G、福美双样品的拉曼光谱信号强度都较弱，但罗丹明6G、福美双分别与纳米银–细菌纤维素柔性膜耦合后，SERS信号显著增强，且随着银纳米颗粒浓度的增加，SERS信号增强效果更明显。因为提升SERS信号强度的关键是Ag NPs产生的“热点”，即控制Ag NPs的空间分布。随着Ag NPs浓度的增加，纳米颗粒之间的间距尺寸减小，并且由于BNC特殊的三维网络结构(图4)，使得本实验制备所得的纳米银–细菌纤维素柔性膜相较于其他平面2D SERS基底，在垂直方向上具有更大的表面积和更高空间的“热点”密度，提高了SERS的灵敏度以及增强了SERS信号强度。
Figure 4. Ag NPs embedded in BNC special 3D network structure
图4. 银纳米颗粒镶嵌在BNC特殊的三维网络结构
4) 细菌纳米纤维素作为衬底与石墨烯纳米墙(GNWs)衬底的对比
我们将图2与GNWs-Ag底检测R6G的拉曼光谱图(文献 [21] 图5-2)进行对比，相比于GNWs (石墨烯纳米墙)基底，使用细菌纳米纤维素为模板后，SERS基底增强效果相似。这表明纳米纤维素可在一定程度上代替石墨烯纳米墙，用于快速和有效地分析样品表面的R6G。
4. 结论
通过研究银纳米颗粒与细菌纳米纤维素混合物制备出的纳米银–细菌纤维素柔性膜，在罗丹明6G、福美双两种SERS分子探针的表面增强拉曼信号图，可得出以下结论：
1) 利用细菌纳米纤维素制备的柔性膜易与载玻片分离，且具有良好的柔韧性，此衬底具有制备简单、环保、可降解等优点；
2) SERS是一种与纳米间距尺寸密切相关的光学物理现象，随着薄膜中Ag NPs浓度的增大，使得薄膜中的纳米颗粒数量增多，缩小了纳米颗粒之间的间距，并且将Ag NPs与BNC均匀搅拌后，Ag NPs负载至BNC的三维网络结构上，提高了Ag NPs分布的空间密度，有效地控制了纳米间距尺寸，显著增强了SERS热点效应。
基金项目
广西师范大学2021年自治区级大学生创新创业训练计划立项(S202110602297)；广西师范大学2021年自治区级大学生创新创业训练计划立项(S202110602307)。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。