基于网络药理学研究升陷汤治疗肺纤维化的作用机制

The Mechanisms of Sheng Xian Tang against Pulmonary Fibrosis: A Network Pharmacology-Based Study

摘要: 目的：为了挖掘升陷汤的有效成分、预测其潜在功能靶标，通过网络药理学探讨升陷汤治疗肺纤维化的作用机制。方法：利用TCMSP数据库筛选升陷汤活性成分及其作用的潜在靶点；通过GeneCards数据库检索与肺纤维化疾病相关的靶点；将疾病相关靶点映射到化合物潜在靶点中，获取药物–疾病共同靶点，并将信息导入Cytoscape4.7.0软件和STRING在线分析平台分别制作网络图和PPI图，再进行KEGG和GO富集分析。结果：共筛选出69个活性成分以及101个关键靶点，涉及PI3K-Akt signaling pathway、Fluid shear stress and atherosclerosis、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications等信号通路。结论：网络药理学研究揭示升陷汤可通过多成分–多靶点–多途径共同调控肺纤维化的物质基础和作用机制，为升陷汤的临床应用提供了理论基础和科学依据。

Abstract: Background: To investigate the main compounds, the underlying functional targets and the me- chanism of Sheng Xian Tang (upraise the sunken decoction, SXT) formula treating pulmonary fibrosis (PF) through network pharmacology analysis. Methods: The main compounds and targets of SXT were mainly collected from the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP). PF relating targets were collected from the GeneCards databases. Subsequently, targets were mapped into the compounds to obtain a compound-disease complex, and then employ STRING online analysis platform and Cytoscape4.7.0 software to generate protein-protein interaction (PPI) networks. Then the related pathways and correlation analysis were explored by the Kyoto Encyclopedia and Genomes (KEGG) and Gene Ontology (GO) analysis. Results: The database results showed that there were 69 active compounds in SXT, and 101 targets were screened out for PF treatment. Network analysis indicated that the main targets of the main active components of SXT were target genes such as PI3K-Akt, Fluid shear stress and atherosclerosis, and AGE-RAGE signaling pathways. PI3K-Akt signaling pathway, Fluid shear stress and atherosclerosis, AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications and HIF-1 signaling pathway, etc. Conclusions: This study helped to validate the material basis and underlying mechanism of SXT for treating PF in a multi-components, multi-targets, and multi-pathways pattern. Additionally, this study provides a theoretical basis and scientific proof for the reasonable application of SXT in the clinical practice for PF.

1. 引言

肺纤维化(pulmonary fibrosis)是以成纤维细胞的过度增生及细胞外基质过度沉积为主的一种慢性、进行性纤维化的间质性肺病疾病 [1]。流行病学调查显示，每10万人中有2.9至42.7人感染此病 [2]。从确诊开始的平均生存期为2~3年，目前缺乏有效治疗手段，预后较差 [3]。中医药凭借其多方位、多靶点、多机制，毒副作用小等特点，对肺纤维化的防治中起着重要作用，并在改善患者肺功能、延缓肺纤维化进程、降低死亡率方面具有明显优势 [4]。临床研究表明，升陷汤用于治疗肺纤维化的疗效肯定 [5] [6]。由于升陷汤为复方，其中药有效成分复杂多样，治疗肺纤维化的药理机制尚不明了。本研究利用网络药理学，通过绘制各种靶点网络图，确定升陷汤有效成分及作用机理，以探讨其治疗肺纤维化的作用机制，为今后的临床研究提供思路和方向。

2. 材料与方法

2.1. 升陷汤所含活性成分的收集与靶点预测

本研究采用中药系统药理学数据库与分析平台 [7] (Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP, https://old.tcmsp-e.com/index.php)，以黄芪、升麻、柴胡、知母、桔梗为关键词检索获取升陷汤的活性成分，筛选活性成分条件为口服生物利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 30%、类药性(drug-likeness, DL) ≥ 0.18 [8]，运用TCMSP数据库靶点预测模型对活性成分的作用靶点进行预测。

2.2. 肺纤维化相关靶点检索

利用“pulmonary fibrosis”为关键词，在GeneCards数据库平台 [9] 疾病基因数据库 (http://www.genecards.org/)进行检索与筛选，并利用UniProt数据库 [10] (Universal Protein, http://www.uniprot.org/)数据库将所得靶点进行统一规范。

2.3. 蛋白互作网络的构建及关键靶点的筛选

为探索靶点蛋白之间的相互作用，把升陷汤治疗肺纤维化的相关作用靶点上传至在线STRING数据库(https://string-db.org/)。将物种(organism)设置为“Homo sapiens”，构建蛋白质互作(protein-protein interaction, PPI)网络。并将互作图中信息保存为tsv格式导入Cytoscape3.7.0软件 [11]，构建疾病–靶点网络图。

2.4. 基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集可视化分析

将网络互作得到的药物–疾病共同靶点基因进行GO生物功能注释及KEGG通路富集分析，并利用R4.0.3分别以柱形图和高级气泡图进行可视化。利用Cytoscape3.7.0软件制作升陷汤治疗肺纤维化预测靶点的“靶点–通路”网络图。

3. 结果

3.1. 升陷汤活性成分及靶点

检索TCMSP数据库，通过OB和DL参数筛选后，共收集到与黄芪相关的活性成分20个，与升麻相关的活性成分17个，与柴胡相关的活性成分17个，与知母相关的活性成分15个，与桔梗相关的活性成分7个，合并删除重复值后获得69个活性成分(如表1所示)。从TCMSP数据库中的Related Targets预测得到成分相关靶点，将靶点预测结果合并后去除重复值，共获得203个靶点。

Table 1. Candidate compounds SXT values and molecular information

表1. 升陷汤部分候选药效成分信息

3.2. 肺纤维化相关靶点检索

检索Genecards疾病数据库，得到肺纤维化靶点为5148个，经筛选后得到相关靶点1290个。然后将203个成分靶点与1290个肺纤维化疾病靶点进行韦恩图绘制，得到101个交集靶点(如图1所示)，即为中药活性成分作用于疾病的相关靶点。交集靶点详细的基因(如表2所示)，其中包括丝裂原活化蛋白激酶(MAKP)、白细胞介素(IL-1β、IL-2、IL-6)等。

注：蓝色圆圈为肺纤维化靶点，红色圆圈为升陷汤药物靶点。

Figure 1. Venn diagram between SXT compound targets and PF relating targets

图1. 升陷汤药物靶点和肺纤维化靶点韦恩图

Table 2. Detailed information of 101 potential targets between PF and SXT

表2. 肺纤维化和升陷汤101个交集靶点详细信息

3.3. PPI网络分析及关键靶点的筛选

在STRING在线数据平台上输入101个共同靶点基因，分析后得到PPI网络(如图2所示)，图中含有51个节点和1921条互作边，平均节点度为38，其中101个节点代表升陷汤和肺纤维化的共同靶点基因，这些可能是升陷汤治疗肺纤维化的潜在靶点。并通过R4.0.3将PPI网络核心基因以柱状图进行可视化(如图3所示)，筛选得到30个关键基因，包括白细胞介素-6 (IL-6, Degree = 87)、血管内皮生长因子A (VEGFA, Degree = 81)、蛋白激酶1 (AKT1, Degree = 80)等。

Figure 2. Network connection of 101 meeting targets genes in SXT

图2. 升陷汤作用的101个共同靶点网络关系图

Figure 3. Column of the volatile compounds in SXT for treating PF

图3. 升陷汤活性成分抗肺纤维化核心靶点信息柱状图

3.4. GO富集分析结果

对101个共同作用靶蛋白进行GO生物功能注释，利用R4.0.3分别对前20个条目进行可视化分析，得到GO富集分析柱状图(如图4所示)，其中纵坐标表示富集条目，横坐标表示富集个数；得到GO富集分析气泡图(如图5所示)，其中纵坐标表示富集条目，横坐标表示基因比率。

Figure 4. Columns of GO enrichment analysis of the main volatile targets in SXT

图4. 升陷汤主要作用靶点GO柱状图

Figure 5. Bubble of GO enrichment analysis of the main volatile targets in SXT

图5. 升陷汤主要作用靶点GO气泡图

3.5. KEGG通路富集分析结果

对101个共同作用靶蛋白进行KEGG富集分析后，到147条KEGG通路，根据P值升序排列，选取前20条通路，利用R4.0.3进行可视化分析，得到KEGG富集分析柱状图(如图6所示)，以及KEGG富

Figure 6. Columns of KEGG enrichment analysis of the main volatile targets in SXT

图6. 升陷汤主要作用靶点KEGG富集分析柱状图

集分析气泡图(如图7所示)，可以看出，101个共同靶点显著富集于多条与肺纤维化相关的通路上，其共同靶点主要富集于PI3K-Akt signaling pathway、Fluid shear stress and atherosclerosis、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications等相关信号通路上。

Figure 7. Bubble of KEGG enrichment analysis of the main volatile targets in SXT

图7. 升陷汤主要作用靶点KEGG富集分析气泡图

3.6. 构建靶点–通路图

将得到的通路条目、靶点信息导入Cytoscape 4.7.0软件，绘制得到靶点–通路图(如图8所示)，其中绿色代表通路，蓝色代表靶点，形状越大代表富集越显著。其中核心靶点主要有：MAPK14、RELA、AKT1、BCL2、JUN、CASP3、MAPK8等。

4. 讨论

4.1. 药物活性成分分析

中医理论中，肺纤维化属于“肺痹”“肺痿”等病范畴 [12]，病位在肺，涉及脾肾，气虚、痰瘀、血瘀为其关键病机，属本虚标实之证，中医临床上主要分为肺肾气虚、肺脾两虚、气虚血瘀、痰阻肺络，当以标本兼顾，以补肺益肾健脾为主，兼以活血通络、化湿祛痰为治疗原则 [13]。升陷汤出自张锡纯《医学衷中参西录》，由黄芪、知母、柴胡、桔梗、升麻组成，为治疗胸中大气下陷证的代表方 [14]。临床观察显示，升陷汤能改善患者肺功能以及血清指标 [15]。药理实验研究表明，黄芪注射液具有黄芪含有的黄芪总苷、生物碱及多糖等成分对肺纤维化具有控制作用，且能改善T细胞功能，纠正机体紊乱状况，有效扩张血管，并促进排痰等，动物实验表明黄芪注射液能下调TNF-α和TGF-β1表达，抑制肺泡上皮细胞EMT现象，从而改善博来霉素诱导的小鼠肺纤维化病理改变 [16] [17]。黄芪甲苷可通过降低VEGF、VEGFR2基因表达水平，来发挥抗肺纤维化的作用，同时，黄芪甲苷对博来霉素诱导的肺纤维化可能存在着一定的抑制作用，其作用机制可能是与α-SMA、COL1、COL3的表达下调，减少了成纤维细胞的形成和胶原蛋白的沉积有关 [18] [19]。另有实验表明黄芪多糖可能通过抑制mTOR及其下游的p-S6的表达，抑制肌成纤维细胞特征标志物α-SMA的表达，影响肺纤维化的发生发展 [20]。柴胡有效成分中柴胡皂甙D可能通过抑制Wnt/β-catenin信号传导通路负向调节EMT，对肺纤维化有一定治疗价值 [21]。桔梗可在药物归经基础下，引导诸药直达病所，引导至相关靶点，进而影响肺部疾病进程 [22] [23]。有研究表明升陷汤中有效成分槲皮素可通过影响炎性细胞因子延缓肺纤维化，通过抑制NF-κB通路减少大鼠炎症细胞、炎症介质TNF-α等释放，缓解肺纤维化过程，也能够通过抑制TGF-β信号缓解肺纤维化 [24] [25] [26]。因此，能够说明在升陷汤中药物有效成分在治疗肺纤维化方面起到关键作用。

Figure 8. Target-pathway networks of SXT in treating PF

图8. 升陷汤治疗肺纤维化预测靶点的“靶点–通路”网络

4.2. 关键靶点与富集结果分析

本研究经筛选后共得出30个潜在关键靶点。根据degree值排名，其中较为重要的为IL-6 (白细胞介素-6)、VEGFA (血管内皮生长因子A)、AKT1 (蛋白激酶1)、JUN、IL-1β (白细胞介素-1β)等。研究表明，在肺纤维化形成过程中有大量淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞的增生，而这些细胞又可以产生IL-6，进而导致IL-6水平升高 [27]。PI3K是磷脂激酶家族中重要一员，其活化产物PIP3能够激活AKT蛋白，进一步磷酸化mTOR的Ser2448位点激活mTOR，从而增强细胞的生长与分化，动物实验验证表明大鼠肺组织中PI3K、AKT、m TOR3种蛋白在肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞中有阳性表达 [28]。张旭辉等 [4] 通过动物实验验证升陷汤可通过降低肺纤维化大鼠肺组织α-SMA、TGF-β1、Smad2蛋白的表达，提高SP-D及Smad7蛋白的表达，减轻肺纤维化大鼠肺组织炎性细胞浸润程度，减少胶原纤维沉积，抑制纤维增生，发挥抗肺纤维化的作用。肺纤维化患者血清瘦素、VEGF的高表达，且表达水平之间的呈现较弱的正相关相关性，提示这两种细胞因子可能在肺纤维化的发生发展中具有互相协同的促进作用 [29]。肺纤维化患者血清中TGF-β1、SATA1表达水平升高，通过相关性分析发现患者血清中TGF-β1、SATA1水平与炎性指标、肺功能、血气分析、HRCT等临床指标间有一定的相关性 [30]。

本研究共获得KEGG通路147条，富集结果显示，升陷汤治疗肺纤维化主要涉及以下几个信号通路：PI3K-Akt signaling pathway、Fluid shear stress and atherosclerosis、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、HIF-1 signaling pathway等。P13K-Akt通路参与细胞的增殖调控，在促进细胞生长、抑制细胞凋亡方面起重要作用，活化的Akt激活mTOR、HIF-1α参与肺纤维化，且与其他通路协同作用促进肺纤维化的形成 [31]。有学者研究报道TGFβ1/Smads信号通路中的Smads蛋白介导了TGFβ1的胞内信号转导，激活纤连蛋白(fibronectin, FN)和胶原等肺纤维化相关靶基因的转录使FN、COL I和COL III等细胞外基质蛋白表达增加，大量ECM沉积，使肺泡结构受到破坏，导致纤维化的发生发展 [32] [33]。VEGF/ VEGFR2信号通路是VEGF信号通路中的主要信号通路，可促进血管内皮细胞的增殖、迁移、分化，同时抑制其调亡，新生的血管为成纤维细胞合成细胞外基质和胶原纤维提供营养物质，最终加重纤维化 [19]。Wnt/β-catenin信号通路是一种进化保守的通路，有调节细胞发生、器官发育、干细胞增殖分化等作用 [34]。有研究表明，肺纤维化患者肺组织中Wnt/β-catenin信号通路活性增加，进而引起肺泡上皮细胞、成纤维细胞异常增殖并促进其分泌胶原纤维 [35]，因此抑制Wnt/β-catenin信号通路可能会抑制肺纤维化的发展，促进肺组织的正常修复，在肺纤维化进程中起着重要作用。

中医网络药理学方法有助于阐释中药复方的组合规则和网络调节效果，并为药物研发策略提供思路 [36]。本研究为升陷汤多成分、多靶点的复杂性以及多途径的交叉性的作用机制提供了科学依据和线索，为升陷汤的后续深入的研究提供了重要理论依据和研究方向，其预测结果还待进一步实验验证。然而，本研究尚存在以下局限性：网络药理学预测结果受限于已有的数据库的收录范围、更新节点；研究未将升陷汤中各味药的剂量、煎煮时间且在煎煮时药物的变化对药效的影响纳入分析。

综上所述，升陷汤治疗肺纤维化的主要成分可能是黄芪甲苷、槲皮素、黄芪多糖等，涉及到的关键通路有PI3K-Akt signaling pathway、Fluid shear stress and atherosclerosis、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、HIF-1 signaling pathway等多条通路，与细胞周期、细胞凋亡、炎症反应等多个生物学过程相关。

基金项目

北京协和医院科研基金资助项目(ZC201906581)。