一种体外扩增NK细胞的新方法

A Novel Method for Expanding NK Cells in Vitro

摘要: 目的：验证一种新型、尚未报道的体外扩增原代NK细胞的方法，同时检测其杀伤活性。方法：采集6位健康志愿者的静脉血共6份，分离外周血单个核细胞。自然杀伤(NK)细胞诱导培养试剂培养14天。利用流式细胞术检测NK细胞所占比例，将K562、THP-1细胞作为靶细胞并用CFSE标记，以效靶比2:1加入扩增后的NK细胞，利用流式细胞术检测靶细胞凋亡。结果：通过14天的细胞培养，利用自然杀伤(NK)细胞诱导培养试剂培养的NK细胞扩增约300倍。NK细胞纯度达50%左右。体外杀伤实验结果显示，扩增后的NK细胞与靶细胞共培养4 h杀伤能力可达40%以上。结论：此种方法扩增的NK细胞其纯度较高，但是因为缺乏其余免疫细胞提供的支撑作用，所以最终NK细胞的扩增倍数并不理想，但其操作简单，花费低，安全性高，可靠性强。

Abstract: Objective: To verify to expand human NK cells ex vivo by using a novel and unreported method and to detect its killing activity. Methods: Mononuclear cells were isolated from 6 samples of peripheral blood from six healthy donors. Natural killer cell induction culture kit was used to culture NK cells from each sample separately for 14 days. The proportion of NK cells was detected by flow cytometry. The K562 and THP-1 cells were used as the targeting cells and the expanded NK cells were added at an effect target ratio of 2:1, and the apoptosis of AML cells was detected by flow cytometry. Results: After 14 days of cell culture, the number of NK cells obtained by natural killer cell induction culture kit for NK cells expanded by 300 times and the ratio of NK cells was about 50.00%. The results of cytotoxicity experiment in vitro showed that the killing ability of NK cells cultured could reach more than 40% when co-cultured with target cells for 4 h. Conclusion: New NK cell culture method using natural killer cell induction culture kit can expand NK cells efficiently and the operation is simple, low cost, high safety and reliability.

1. 引言

目前许多免疫疗法都旨在增强NK细胞对造血系统恶性肿瘤的细胞毒性作用 [1]。最先进的技术已经揭示了NK细胞在安全性和靶向非肿瘤效应方面的显著优势，所以NK细胞被认为是CAR修饰T (CAR-T)细胞的替代物 [2]，用于治疗血液系统恶性肿瘤和实体瘤。目前存在许多NK细胞的培养方法 [3] [4] [5]，最开始的试验中，借助免疫磁珠的方法将血液中所含有的NK细胞(CD3−/CD56+)单独分离出，再使用无血清培养液(其中含自体血浆 + IL-2又或其余细胞因子)进行扩增NK细胞。此种方法扩增的NK细胞其纯度较高，但是因为缺乏其余免疫细胞提供的支撑作用，所以最终NK细胞的扩增倍数并不理想。另外，利用免疫磁珠对NK细胞提纯，花费高，同时需要特殊的设备仪器，使得NK细胞难以在临床中应用 [6]。近期，许多研究利用单个核细胞进行扩增培养NK细胞，同时将K562细胞用作其滋养层。但是K562细胞为白血病细胞的一种，在检测NK细胞的杀伤活性时常用作靶细胞，并且，K562细胞所分泌的微囊能够导致正常的造血细胞发生恶变 [7]。所以，将K562细胞用作滋养层，阻碍其临床使用的最大障碍便是安全问题，特别是长期的安全性不能得到保证。目前研究较多的方法还包括纯细胞因子诱导法，将IL-2，IL-15，IL-12，IL-21，IL-18等细胞因子添加至培养扩增NK细胞的过程之中，但是，该培养方法的稳定性较差 [8]，常常由于个体差异导致结果相差甚远，达不到临床试验所要求的标准。所以如何获得高纯度和高活性的大规模临床级NK细胞，成为以NK细胞为基础的肿瘤免疫治疗的最主要障碍 [9]。在此，我们对一种新型的、以往文献中尚未报道的原代NK细胞扩增和培养方法进行了验证，探讨其扩增NK细胞的能力。

2. 材料和方法

2.1. 主要试剂与仪器

自然杀伤细胞诱导培养试剂(其中包括NK细胞无血清培养基、NK细胞激活剂、NK细胞活化剂达科为，深圳)，胰蛋白酶(北京，索莱宝)，Ficoll分离液(北京，索莱宝)。抗人CD3抗体(美国BioLegend)，抗人CD56抗体(美国BioLegend)，自体血浆，PE-Annexin V/7AA调亡检测试剂盒(美国BioLegend)。低温高速离心机(Thermo美国)，水浴锅(Fisher美国)，超净工作台(中国海尔)，流式细胞仪(Becton-Dickinson, USA)，光学显微镜(Olympus Jpan)，细胞培养箱(Thermo Germany)。

2.2. 实验对象

选取济宁医学院附属医院工作的健康志愿者6人，年龄为20~26岁(中位年龄23岁)，其中2例男志愿者，4例女志愿者，为入选的每位志愿者进行无菌采外周血20 ml，抗凝管均为肝素钠，进行采血前每位志愿者均签署了《知情同意书》；在外周血采集之后4小时内开始进行试验。每位志愿者的血标本单独处理并获得一次独立的实验结果，此次研究获得本医院伦理委员会的批准(JYHL2018FZD004)。

2.3. 外周血单核细胞的分离

首先使用75%的酒精消毒含有所需实验标本的抗凝管外部，而后将抗凝管转移到经过紫外线消毒30 min的超净操作台内，取50 ml离心管，将10 ml淋巴细胞分离液加至50 ml离心管内，50 ml离心管倾斜约30˚，将外周血贴着管壁慢慢的加入，使外周血能够浮在淋巴细胞分离液的表面，防止加样速度过快，避免血液和淋巴分离液混合。室温下2500 rpm，离心15分钟，离心结束之后，可以清楚的观察到离心管的分至4层：从上到下分别为血浆、白膜层(亦即单个核细胞)、淋巴细饱分离液层以及红细胞层，首先吸取最上层淡黄色透明的血浆于新的15 ml无菌离心管内，封口膜封口，56℃水浴锅内灭活30分钟，1000 g 离心10分钟取上清制得热灭活的自体血浆。随后将白膜层小心的吸取到新的无菌离心管内。在无菌管内加入PBS将细胞洗涤2次，3000 rpm，5 min。

2.4. NK细胞的扩增和培养

将新鲜分离的5 × 10⁶个单个核细胞接种至T25培养瓶中，培养瓶内加入6 mL NK细胞扩增培养基(加入NK细胞活化剂)，600 μl热灭活自体血浆(所占比例为培养基体积的10%)，同时加入12 μl NK细胞激活剂(每ml培养基2 μl激活剂)。放入培养箱内(条件为37℃，5% CO₂)进行培养。

第3天，显微镜下观察细胞状态，若细胞已开始形成克隆团，进行等体积补液(6 ml NK细胞扩增培养基，600 μl热灭活自体血浆)。D5天起，每两天进行1次取样计数，根据细胞的密度(调整NK细胞密度为每ml 1.0~1.5 × 10⁶个)决定补加NK细胞扩增培养基的量，此时血浆浓度可降为5%。D7天之后，所加培养基内的热灭活自体血浆浓度可以降低到1%。14天为1个培养周期。

2.5. 检测NK细胞的纯度

在第0、5、7、11、14天分别收集细胞于1.5 ml EP管内，通过流式细胞数检测CD3、CD56标志物。将收集的细胞进行离心、PBS洗涤后，用100 μl PBS将细胞重悬，注意操作轻柔，随后加入3 μl CD3、CD56抗体，轻轻的吹打使之充分混匀，4℃冰箱内避光孵育30 min。进行孵育抗体时，间隔5分钟震荡离心管，使得细胞和抗体能够充分的接触。30 min后，向EP管内加入200 μl PBS。而后应用流式细胞仪进行检测，收集分析20,000个细胞，扩增NK细胞的纯度等于CD3− CD56+所占总细胞的比例。

2.6. 检测NK细胞的杀伤能力

将培养14天的NK细胞收集作为效应细胞，K562、THP-1细胞作为靶细胞。首先使用荧光染料CFSE对靶细胞进行标记，用1640培养液(10% GIBCO血清)将细胞浓度调整至6 × 10⁵/mL。按照效靶比2:1加入相对应数量的NK细胞；每个孔均设置了相同的3个复孔，放置于37℃，5% CO₂培养箱内孵育4小时。4小时结束之后，细胞全部收集，离心、PBS洗涤后，用100 μl Binding Buffer重悬细胞，而后将3 μl Annexin V以及7-AAD加至每管中，室温下避光孵育15分钟，孵育结束之后再向管内加入200 μl Binding Buffer，准备应用流式细胞仪进行检测，同时分析数据。

3. 结果

3.1. NK细胞生长增殖情况

在NK细胞体外培养培养过程中收集细胞，利用流式细胞术进行分析。结果表明，体外培养14天时NK细胞比例可达50.12% ± 6.05%，细胞数量由5 × 10⁶个增至1.0~3.0 × 10⁹个，扩增约300倍，其中第5~11天，NK细胞增长速度最快。并且应用此种方法并不会导致CD3阳性T细胞的扩增，同时细胞保存着良好的生存状态。详见图1~3。

Figure 1. Changes in NK cell proportions

图1. NK细胞比例变化

Figure 2. The proportion of NK cells changes

图2. NK细胞比例变化趋势

Figure 3. NK cell morphology (light microscopy 10×)

图3. NK细胞形态(光学显微镜10×)

3.2. NK细胞体外杀伤能力的检测

于NK细胞体外培养第14天，检测体外杀伤能力。通过流式细胞仪分析可以得出在效靶比为2:1时，对K562、THP-1细胞株的杀伤效率均超过40%，且对K562细胞的杀伤作用优于THP-1，并且发挥作用迅速，能够在4小时之内发挥杀伤作用。详见图4。

Figure 4. The killing ability of amplified NK cells to target cells

图4. 扩增后的NK细胞对靶细胞的杀伤能力

4. 讨论

本次研究应用的是一种新的、临床级别的细胞培养液，但是以往文献中尚未对该方法进行报道，此方法操作较为简单，并且花费少，只需要将外周血单个核细胞分离出来，调整至适合的细胞浓度后便可直接进行体外扩增，不需要加入有安全隐患的饲养细胞(例如经γ射线辐照之后的K562细胞)，同时不需要加入额外的细胞因子，通过14天的培养，细胞总数可以达到约300倍的扩增，NK细胞的纯度可达50%左右。但是该方法因为缺乏其余免疫细胞提供的支撑作用，所以最终NK细胞的扩增倍数低于细胞因子方法以及饲养层细胞方法。此种方法进行NK细胞扩增时需注意以下2个问题：1) 勿将2个或者3个志愿者的外周血所提取的单个核细胞进行混合培养，如此进行不仅会减缓NK细胞扩增的速度，还会影响细胞的状态。2) NK细胞是一种半贴壁半悬浮细胞，团簇状生长，若在培养过程的第3天或者第5天细胞仍未形成克隆团，又或是基本全部为悬浮细胞，那么也意味着此次的扩增可能失败。

在本研究中同时尝试了另外两种扩增NK细胞的方法，包括研究最多的饲养细胞层法，我们构建了含有K562-41-BBL-IL-15细胞饲养层，使用1640培养基(含10% Gibco血清)，每两天进行换液并加入200 IU/L的IL-2，最终扩增的NK细胞比例最高也仅为7.00%左右(结果未显示在本文，NK细胞原始比例1.00%左右)。通过查阅文献 [10] 发现来那度胺可以增强NK细胞的活性，由于姜黄素和来那度胺同为免疫调节小分子药物，所以我们便将来那度胺、姜黄素分别加入至分离的单个核细胞培养基内进行刺激，结果相对于来那度胺而言，姜黄素刺激NK细胞的效果更为显著，培养14天NK细胞扩增的比例同样可达7.00%左右(本文未显示该结果，NK细胞原始比例1.00%左右)，故姜黄素同样可以促进NK细胞的扩增，但是由于最终扩增数目不多，且纯度不高，未再深入研究。

综上所述，采用NK细胞诱导培养试剂盒扩增NK细胞的方法，虽然最终NK细胞的扩增倍数并不理想，但其操作简单，花费低，安全性高，可靠性强，可以为临床应用提供一种新的扩增方法。

基金项目

山东省自然科学基金(ZR2021MH320)。