耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药现状及耐药机制研究

Drug Resistance Status and Mechanism of Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae

摘要: 肺炎克雷伯菌作为革兰氏阴性机会致病菌，常定植于人体口腔、呼吸道、胃肠道、泌尿道，是引起院内和社区获得性感染中重要的肠杆菌科。碳青霉烯类抗生素是治疗肺炎克雷伯菌感染的常用药物，然而，随着近年来临床上碳青霉烯类抗菌药物的广泛使用，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的患病率以惊人的速度上升，其多重耐药性正在成为一个日益严重的全球性问题，为临床治疗带来了巨大挑战。本文就近年来耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药现状及分子耐药机制进行综述，为预防及有效遏制该菌的传播提供依据。

Abstract: Klebsiella pneumoniae, as a gram-negative opportunistic pathogen, is often colonized in human oral cavity, respiratory tract, gastrointestinal tract and urinary tract. It is an important enterobacteri-aceae that causes nosocomial and community-acquired infections. Penicillium carbon alkene is an-tibiotic treatment of Klebsiella pneumoniae infection commonly used drugs, however, as in recent years, the clinical Penicillium carbon alkene the wide use of antimicrobial agents, resistance to car-bon Penicillium the prevalence of alkene pneumonia klebsiella bacteria rising at an alarming rate, its multiple drug resistance is becoming an increasingly serious global problem, has brought the huge challenge for clinical treatment. This article reviews the drug resistance status and molecular resistance mechanisms of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in recent years, so as to provide a basis for preventing and effectively curbing the spread of the bacteria.

1. 引言

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, KP)是与临床感染(如肺炎、尿路感染、脓毒症、手术切口感染、肝脓肿、脑膜炎等)相关的最常见革兰氏阴性病原体之一 [1]。作为机会性致病菌，可导致免疫力低下的婴儿、儿童以及老年患者或长期服用免疫抑制剂的患者发生危及生命的感染 [2] [3] [4]。长期以来，碳青霉烯类抗生素是临床治疗肺炎克雷伯菌感染的常用药物 [5]。但是，随着碳青霉烯类抗菌药物的普遍应用，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae, CRKP)已在全球范围内不断出现和传播，给感染控制带来严峻挑战。同时，有研究表明 [6] [7]，相较于对碳青霉烯类敏感的肺炎克雷伯菌，CRKP有着更高的医疗费用，为患者带来更大的经济负担。并且会导致患者病程延长，伴随高致死率。因此，CRKP的感染问题已成为最紧迫的公共卫生威胁之一。本文就CRKP耐药现状及耐药分子机制的研究进展做一综述，拟对制定合理的抗生素使用策略提供参考信息。

2. CRKP耐药现状

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌在20世纪90年代被首次发现，随后，在世界各国相继出现。Mackenzie等 [8] 首次报道了耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌，引发临床关注。Yigit等 [9] 于1996年在美国北卡罗莱纳州医院分离了第一株由质粒介导的肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶，其对亚胺培南和美罗培南呈现出高度耐药性，进一步引起临床重视。2009年，Yong D等 [10] 报道了印度新德里发现的一种“超级细菌”，对包括碳青霉烯类在内的几乎所有β内酰胺类抗生素耐药，其广泛耐药性令临床工作者担忧。

近年来，CRKP的检出率不断上升，耐药率呈递增态势。王珊珊等 [11] 调查某医院5年间CRKP的分离情况，结果显示，CRKP的分离率由2014年的0%上升至2018年的26.5%，呈快速上升趋势。周馨等 [12] 报道中国科学技术大学附属第一医院4年间KP菌株的分布及耐药情况，从1099株KP菌株中检出CRKP菌株159株，占14.47%，且医院CRKP检出率由2014年的11.6%增至2017年的16.06%。杨程茹等 [13] 对重症监护病房CRKP的耐药分子机制进行研究，结果显示：51株CRKP菌株对亚胺培南和美罗培南的耐药率为96.1%和98.0%，呈现出高度耐药性。在一项对ICU患者CRKP耐药机制的研究中发现 [14]，59株CRKP除对多粘菌素B、米诺环素、复方新诺明、阿米卡星、庆大霉素的耐药率较低(均<32.2%)，对其他抗生素菌有较高耐药率(均>70%)，提示CRKP菌株已形成多重耐药性。郑军涛 [15] 等对134株KP菌株的耐药性趋势进行研究，结果发现134株KP菌株中，CRKP占68株(50.4%)，主要分布在重症监护室、呼吸内科及肿瘤科等，其中基因组序列中有65株为ST11型，ST11型菌株中携带KPC-2基因的有60株，并且对亚胺培南和美罗培南的耐药率均高达100%。王群等 [16] 回顾性分析上海某三级综合医院2016年至2020年5年间CRKP的检出趋势，结果显示5年间CRKP的检出率有波动，均 > 30%。据2021年中国细菌耐药检测网(CHINET，http://www.chinets.com)的数据，肺炎克雷伯菌在临床分离的革兰氏阴性杆菌中占19.8%，位列第二，其对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别从2005年由3%和2.9%升高至2021年的23.1%和24.4%，虽较2018年的耐药率25%和26.3%有所下降，但情况仍不容小觑。2018年欧洲抗菌素耐药检测网的数据提示KP对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为26.6%和17.6%。同时值得关注的是，CRKP引起国内外院内感染爆发性流行的事件时有发生，在英国、意大利、我国山东等地均被报道过。因此，面对CRKP逐年升高的患病率，临床需进一步关注，应加强对CRKP的耐药监测，同时加大碳青霉烯类抗生素规范应用的管理，避免引发CRKP的爆发感染和广泛流行。

3. 耐药分子机制

目前，CRKP感染在许多国家迅速成为一种危及生命的院内疾病，临床上抗生素的有限选择已不能满足患者的治疗需求。与对碳青霉烯类敏感的KP相比，CRKP感染的患者有更高的死亡率 [17]。因此，为帮助临床合理用药提供依据，探究CRKP的耐药机制势在必行。CRKP的耐药性与其产生及携带不同的耐药基因有关，目前，已发现的KP对碳青霉烯类抗生素的耐药机制主要包括以下4种：1) 产碳青霉烯酶，是产生耐药性主要机制；2) 高水平产头孢菌素酶(Axiomatic Multi-Platform C, AmpC)或超广谱β内酰胺酶(Extended Spectrum Beta-Lactamases, ESBLs)同时合并外膜孔蛋白(Outer Membrane Protein, OMP)缺失或表达下调；3) 细菌的主动外排泵系统；4) 高亲和位点青霉素结合蛋白(Penicillin Binding Proteins, PBPs)的缺失或亲和力下降 [18] [19]。上述耐药基因通过单独或协同作用，使KP对碳青霉烯类抗菌药物的敏感性降低。

3.1. 碳青霉烯酶

碳青霉烯酶是一种可以水解包括青霉素类、头孢菌素类以及碳青霉烯类抗生素的β内酰胺酶。根据Ambler分子分类，将β内酰胺酶主要分为以下4个类别：A、B、C、D。其中，A、B、D包含碳青霉烯酶，是KP耐碳青霉烯类抗生素的主要耐药机制。

3.1.1. A类酶

A类酶是以丝氨酸为活性位点的非金属β内酰胺酶，包括KPC、GES、SME、IMI等，其中，产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase, KPC)是A类酶中最重要的酶。KPC可凭借不同移动遗传元件，如转座子(Tn4401b)和多种质粒(IncFII、IncN等)，在不同菌株之间迅速扩散，引起广泛传播和流行，给临床治疗带来极大困难。自1996年在美国北卡罗纳州的一例肺炎克雷伯菌分离株中发现了KPC-1 (后来证明KPC-1与KPC-2为同一种酶)，迄今为止，已发现报道了20多种不同的KPC分型。全球范围内主要以KPC-2、KPC-3为流行，国外报道以KPC-3型为主，国内KPC-2型多见。贺宇等 [20] 对收集的91例CRKP菌株进行耐药基因分析，其中KPC-2的阳性检出率最高，为65株(71.4%)，克隆分型中ST11型菌株最多，占43株(47.3)，提示CRKP耐药主要与KPC-2有关，ST11为CRKP的主要克隆分型，引发克隆扩散。胡小品等 [21] 对中国西南地区3所综合性医院内CRKP的耐药基因进行研究，结果发现159株CRKP菌株中只携带KPC-2的菌株为129株(81.1)，有9株同时携带KPC-2和NDM-1，符合国内的流行趋势。黄静敏等 [22] 对广东地区CRKP的耐药性及分子流行病学进行研究发现，收集的41株CRKP均为泛耐药菌，对亚胺培南的耐药率高达80.49%，41株CRKP经过耐药基因序列分析后，共有31株(75.61%)检测出碳青霉烯酶基因，包括bla_KPC-2(18株)、bla_NDM(12株)、bla_IMP-4(1株)，提示该地区CRKP的耐药机制主要是产碳青霉烯酶，其中又以KPC-2为主要流行，克隆分型中以ST11型为主，占21株(51.22%)，提示优势克隆ST11型CRKP在医院间广泛流行和传播。

3.1.2. B类酶

B类酶为金属β内酰胺酶(Metallo Beta Lactamases, MBLs)，是锌依赖性酶，其活性位点含有锌离子，需依赖锌离子发挥催化活性，锌离子和其他二价阳离子作为辅助因子，通过催化底物的酰胺键水解裂解，使包括碳青霉烯类在内的几乎所有β-内酰胺类抗生素失活，但它也能被乙二胺四乙酸(EDTA)等金属整合剂抑制。B类金属酶包括NDM(新德里金属酶)、VIM、DIM、IMP、GIM等。其中，NDM是最常见的。NDM-1于2008年首次在一位印度裔瑞典患者的尿液中被分离出来 [10]，其对除粘菌素以外的所有抗生素产生耐药。近年来，国内外NDM-1的报道呈上升趋势，携带NDM基因的KP除粘菌素外，对其他所有抗生素都呈现出耐药。Toledano等 [23] 发现bla_NDM-1能通过质粒IncFII进行水平转移。有研究报道 [24] [25]，粘菌素-EDTA联合疗法能产生有效的协同作用，但因EDTA具有毒性，阻碍了其临床使用。

3.1.3. D类酶

D类酶的活性部位具有丝氨酸结构，能水解苯唑西林及氯唑西林，故被称为苯唑西林酶(OXA酶)，肺炎克雷伯菌有OXA-23、OXA-48、OXA-52、OXA-58等亚组，其中最常见的是OXA-48，由质粒编码，通过移动遗传元件在不同菌属的肠杆菌科中传播。OXA-48于2001年首次在土耳其被发现 [26]，随后，在法国、西班牙、意大利、印度、中国等国家均有报道 [27]。有研究表明 [28] [29]，携带OXA-48的KP菌株可同时产KPC及NDM，其对β内酰胺类抗生素表现出高度耐药性。OXA-48的变体包括OXA-181、OXA-162、OXA-244、OXA-232等。有报道发现 [30]，与其他类型变体相比，OXA-232具有较弱的碳青霉烯酶活性，但合并外膜蛋白突变时，能引起高水平的碳青霉烯类药物耐药性，并能通过ST15克隆扩散。

3.2. 高产AmpC酶

AmpC酶为头孢菌素酶，主要包括DHA、ACC、MOX、CMY、ACT等，国外多以CMY-2型报道，国内以DHA-1型和ACT-1型多见。AmpC酶可分为染色体介导型和质粒介导型，染色体介导的AmpC酶主要水解第三代头孢菌素。与染色体介导的AmpC酶不同，质粒介导的AmpC酶可以水解第一、二、三代头孢菌素，头霉类，氨曲南，并且可以高水平表达 [31]。通过接合、转化、转导、转座子等方式，将AmpC基因导入肺炎克雷伯菌内，使其产生AmpC酶，能有效水解头孢菌素类及单酰胺类抗生素，并在不同菌株间水平传递耐药基因。大多数AmpC酶不受经典抑制剂如克拉维酸、舒巴坦、阿唑巴坦的抑制，然而，他们对新的抑制剂如阿维巴坦、利巴坦表现出敏感 [32] [33]。Shi等 [34] 发现携带DHA-1基因合并OmpK36突变的肺炎克雷伯菌表现出对碳青霉烯类抗生素高水平耐药性。

3.3. ESBLs

ESBLs是由质粒介导的超广谱β-内酰胺酶，包括TEM、SHV、CTX-M、GES、PER、VEB等，能水解青霉素类、第一到第四代头孢菌素类及单环β-内酰胺类抗生素。Le等 [35] 在对KP感染的临床特征分析中发现产ESBLs的菌株相较于社区更普遍存在于院内。近年来，CTX-M已超过TEM型和SHV型成为最主要类型，在全球范围内流行。Cao等 [36] 研究报告了一例同时携带mcr-1、bla_NDM-5、bla_CTX-M-55基因的肺炎克雷伯菌，其拥有水平转移的能力，能在肠杆科菌株中传播，并且对包括多粘菌素在内的多种药物产生耐药。

3.4. OMP缺失或表达下调

革兰氏阴性菌细胞壁的最外层是一层外膜蛋白，外膜的通透性决定了抗生素的摄取率，从而决定了抗菌治疗的疗效。亲水性药物如β-内酰胺类抗生素依赖于通过形成孔隙的外膜蛋白的扩散以进入细菌体内，当特异的孔膜蛋白缺失或表达下调时，可使相应的抗生素无法进入菌体内，从而产生耐药。肺炎克雷伯菌外膜的孔蛋白包括OmpK35、OmpK36、OmpK37、OmpK38、PhoE、OmpK26。其中，起最主要是OmpK35、OmpK36。Ejaz [37] 在分析79株CRKP菌株时发现：产ESBL菌株占36.7% (29株)，而OmpK35缺失的菌株在这29株中占44.8% (13株)，OmpK36缺失的菌株占27.5% (8株)，产ESBL的菌株同时合并孔膜蛋白的缺失除替加环素及粘菌素外，对其他抗生素均表现出高度耐药。

3.5. 主动外排泵系统

外排泵是将抗生素从细胞内部排出体外的细菌转运蛋白，编码这些转运蛋白的基因常在耐药细菌中发现，并且通常是操纵子的一部分，其表达在转录水平上受到调节，调节蛋白中的突变或启动子的突变导致这些外排泵过度表达，将进入细菌体内的抗菌药物主动排出体外，能有效降低细菌内的抗生素浓度，从而产生耐药 [38]。肺炎克雷伯菌最主要的外排泵是AcrAB-TolC，可由ramA、soxS等基因激活。国内一项研究发现 [39] Tamra和soxR基因的突变可导致ramA和soxS转录调节因子的上调，从而诱导AcraB-TolC外排泵基因的过表达，导致替加环素耐药性。

3.6. PBPs的缺失或亲和力下降

PBPs即青霉素结合蛋白，是一类位于细菌细胞膜上的脂蛋白，具有很高的转肽酶活性，在细菌细胞壁重要组成结构肽聚糖的生物合成过程中必不可少。同时，PBPs是β-内酰胺类抗生素的高亲和力靶位点，β-内酰胺类抗生素与PBPs与共价结合后，能抑制PBPs酶的活性，阻碍细菌细胞壁的合成，从而起到杀菌作用。不同种属细菌所含PBPs的种类和数量各不相同，但在结构和功能有一定相似性。Sutaria等 [40] 研究发现两种β-内酰胺抗生素联用及β-内酰胺抗生素与β-内酰胺酶抑制剂组合使用可使PBPs表达增加，实现协同杀菌作用。

4. 小结与展望

CRKP在临床中可引发严重感染，其多重耐药性及高死亡率已成为全球范围内紧迫的公共卫生问题之一。CRKP的耐药机制复杂，通过产生不同的耐药基因，并借由遗传移动元件传递，从而引起扩散和流行。因此，遏制CRKP的进一步流行传播刻不容缓。展望未来，在主动对CRKP菌株耐药监测的基础上，积极开展耐药分子基因检测，掌握本地区CRKP菌株的耐药特点和传播趋势，并规范抗生素的应用，以减少CRKP的爆发和流行。