病原微生物高通量测序在儿童感染性疾病诊断中的应用现状

Application of High-Throughput Sequencing of Pathogenic Microorganisms in Diagnosis of Infectious Diseases in Children

摘要: 感染性疾病是世界范围内儿童死亡的主要原因之一。近年来循证医学逐步发展，病因诊断变得越来越重要。依靠传统方法已无法满足目前医学环境下诊断和治疗的需要，宏基因组学下一代测序(mNGS)逐渐显示出其在病原体诊断方面的独特优势。本文旨在通过综述近年来国内外mNGS应用相关文献，介绍其在感染性疾病诊断和治疗中的提示意义。

Abstract: Infectious diseases are the leading cause of death of children worldwide. With the development of evidence-based medicine in recent years, etiological diagnosis becomes more and more important. Relying on traditional methods has been unable to meet the needs of diagnosis and treatment in the current medical environment. Metagenomic next-generation sequencing (mNGS) has gradually shown its unique advantages in pathogen diagnosis. This article aims to introduce the significance of mNGS in the diagnosis and treatment of infectious diseases by reviewing the relevant literature on the application of mNGS at home and abroad in recent years.

1. 引言

儿童患感染性疾病容易快速发展为危重症，早诊断早治疗是影响儿童感染性疾病预后的重要因素，明确病原是儿童感染性疾病早期治疗的关键。由于儿童感染性疾病临床表现不典型、病原学依据获取困难，临床工作中应用传统病原体检测方法如PCR、特异性抗原抗体检测、细菌培养等常常仍不能明确病原，使儿童感染性疾病的病原学诊断陷入困境，因此需要更灵敏的检测技术作为传统检测技术的补充。宏基因高通量测序 [1] (metagenomic next-generation sequencing, mNGS)临床研究开始探索其实用性，以及耐药基因检测、传染病爆发、各类病因不明疾病等的应用。本文主要探讨临床mNGS文献的最新进展，重点是已发表的儿科数据。让临床医生更深入地了解mNGS的优缺点。并为需要进一步研究的领域提供方向。

2. mNGS的发展历史

mNGS [1] 是一种用于鉴定临床标本中微生物的DNA和RNA的新型基因检测技术，在一次测试中直接对样本中所有核酸成分进行测序，并与数据库匹配，从而实现无假设的检测和综合诊断，是一项革命性的新技术。基因组测序于1977年首次开展，Sanger sequencing发展为第一代测序 [2]，此后，各种测序手段飞速发展，统称为“下一代测序”(NGS)，NGS在诊断中最常见的应用包括 [3]：1) 靶向扩增子测序，涉及用不同方法富集特定基因区域；2) mNGS对标本的宿主和病原体的所有核酸进行平行测序。本文重点介绍mNGS在识别儿童感染性疾病标本中病原体核酸的应用。

3. 宏基因组在儿童感染性疾病中的应用

3.1. mNGS在呼吸道感染疾病中的应用

姚仲伟 [4] 等人分析了29例诊断为重症社区获得性肺炎患儿的BALF的传统病原学与mNGS检测的诊断效能。发现细菌检出率、病原体阳性率及混合感染检出情况，mNGS均明显高于传统检测方法。马彩霞 [5] 等人分析了47例儿童重症肺炎支原体肺炎的BALF病原学结果，发现mNGS测得混合感染明显高于传统病原学检测。尤其对合并病毒感染的检测，与临床PCR结果完全相符，且mNGS能早期进行病毒分型和病毒载量分析，这说明mNGS对于病原体检测快速且准确，对于小年龄的危重症儿童来说，早期行mNGS检查有助于精准诊疗，改善预后。

血流感染是重症肺炎患者常见的并发症，被认为是预测不良预后的独立危险因素。因此在临床工作上，对于不便行支气管镜的重症患儿可优先选择血样本。Gangfeng Yan [6] 等人分析了PICU收治的34名儿童血液样本mNGS结果与血清炎症指标、淋巴细胞亚群的关联，认为耶氏肺孢子虫的丰度与总白细胞计数和免疫缺陷的减少呈正相关；与社区获得性肺炎儿童相比，医院获得性肺炎患者的血液细菌种类丰富度显著增加，血流细菌丰度与血清降钙素原水平呈正相关。

Henan Li [7] 等人发现肺组织的mNGS对于检测患者肺部是否存在病原体的速度和灵敏度方面具有潜在优势，且与组织病理学方法相比，mNGS在真菌和结核分枝杆菌的评价中表现出最高的特异性，然而需要对mNGS进行准确的数据管理和解释。Sander van Boheeme [8] 等人对呼吸道样本进行回顾性验证发现mNGS的灵敏度和分析特异性与PCR相当，在考虑非 PCR目标病毒病原体时更高。Zheng [9] 等人通过对29例重症肺炎患儿的临床资料进行单因素分析发现入院前是否使用抗生素不会影响mNGS的检测结果，可以弥补传统培养难克服的缺陷。

3.2. mNGS在中枢神经系统中的应用

脑膜炎及脑炎的诊断及治疗多依赖于早期明确病因 [10]，因此临床工作上早期识别病原体尤为重要。在经验治疗组中，mNGS的检出率显著高于常规方法。对于疑似中枢神经系统感染的患者，mNGS可显着提高病因诊断率，有效指导临床策略 [11]。Guliz Erdem [12] 等人使用脑脊液mNGS来诊断患有不明病因脑炎或脑膜脑炎患儿的感染。采用已知肠病毒性脑膜炎患者和原发性颅内高压患者的脑脊液作为对照。结果表明实验组27例患者在阳性对照组中，mNGS正确识别了肠道病毒并明确基因型。在阴性对照组中未检测到病毒序列。亦有研究表明mNGS可能根据序列数判断病情程度及病程长短，以及对比评估病情好转程度 [13] [14]。

mNGS可以补充传统的诊断方法，以确定病因，进行监测，并预测暴发。Saha [15] 等人进行了一项回顾性研究，该研究以患儿脑脊液的mNGS来确定原因不明病例的病因的验证和应用研究，发现有3例神经侵入性基孔肯雅病毒(CHIKV)，与此前被确认为此前毒株之间相同度大于99%，之后对同年出现特发性脑膜炎儿童所剩余储存的472个CSF样本进行特异性qPCR，发现了17例CHIKV脑膜炎，暴露了一个未被确认的脑膜炎爆发。对于临床表现缺乏特异性的儿童结核性脑膜炎感染、脑脊液结果不典型情况下，早期行mNGS检测在一定程度上可以提高诊断精确度 [16] [17]。

3.3. mNGS在传染性疾病中的应用

病原学的检测开始进入生物信息时代，mNGS可以追溯传染源及预测传染病的暴发。尚永朋 [18] 等人收集了同期发热伴腹泻或皮疹的新生儿、其他新生儿、医护人员以及环境标本进行mNGS检测。有症状新生儿mNGS均检出肠道病毒，18例无症状新生儿检出2例。医务人员及环境标本未检出。提示mNGS能有效辅助诊断肠道病毒感染，并且具有追溯医院聚集性肠道病毒感染病原体的潜力。提示我们工作中同病房内如果同时或先后出现入院后腹泻患儿需警惕肠道病毒院内传播，预防院感发生。Doyle V. Ward [19] 等人发现基因组和临床流行病学数据的整合可以增强感染控制监测，以及识别交叉传播事件。更深入地了解医疗保健环境中的交叉传播事件将需要扩展当前的监测方法。Hanna Jerome [20] 等人使用mNGS对40名发热 ≥ 38℃的返回旅行者的血浆样品进行测序，并与临床诊断分析进行比较。发现登革热病毒、戊型肝炎、博拉病毒、甲型肝炎、基孔肯雅病毒感染。在目前疫情全球化时代，mNGS有助于发热返乡旅客病毒感染的诊断，及时了解病毒种类，有效预防疫情播散。

mMGS目前也常应用于儿童结核病的诊断。许愿愿 [21] 等人报导了3例结核相关检查阴性，经mNGS早期诊断重症结核病病例，BALF及静脉血mNGS均检出TB，序列数在1~34之间，相较于细菌、病毒而言，序列数较低，但对于mNGS检出的培养条件较严苛的非环境定植菌，标本受污染可能性较小，若临床表现符合，应高度考虑致病菌可能。刘霞 [22] 等人回顾分析了19例明确为活动性肺结核患儿mNGS、XPERT结果，发现一定程度上mNGS可以弥补XPERT假阴性的检出，但如果推广mNGS为诊断结核病的常见手段，还需克服结核分枝杆菌的特点，提高标本检出率。Wen [23] 等人通过基因数据库分析发现并验证了4个结核相关基因，并可能成为有效的生物标记物，从而方便用于国人的结核病诊断。结核相关基因的完善使得mNGS具有检测多个耐药位点以进行精确治疗的潜力。

对于寄生虫诊断mNGS有其独特优势。对于儿童患者而言，流行病史较隐匿，临床症状和体征缺乏特异性，易延误诊治，且病情进展快、较危重，若没有及时治疗易转为重症甚至危及生命。在抗体检测阴性时，mNGS则能发挥一定作用。罗智强 [24] 等人报导了3例儿童广州圆线虫脑膜炎病例，CSF中mNGS检测到序列数为718~5109，占总寄生虫序列数的比值超过99%。而寄生虫抗体检测只有1例检出。Du [25] 等人报导了首例因反复出现肩部和胸部疼痛以及呼吸急促为临床表现，最后通过组织mNGS确诊为儿童曼氏裂头蚴病的案例。mNGS可作为抗体检测、活检的补充诊断手段。林威 [26] 等人报道了3例以发热及多系统受累为主要临床表现的患儿，使用多种抗生素治疗无效，且无典型焦痂体征患儿，经mNGS检测后提示恙虫病东方体感染。mNGS为不常见病原体引起的特定传染病提供了临床上准确高效的诊断，特别是临床表现不典型，实验室指标不能明确的情况下 [27] [28]。

4. mNGS在临床应用中的问题

mNGS在临床上运用中也存在许多问题。第一是不同的部位标本的选取及处理方法会影响结果，从微生物菌群丰富的样本中可检测出多种病原体。而罕见的病原体和治疗后减少的细菌种群可能被二代测序解释为背景细菌，如何精准选取标本及处理是需要解决的技术问题。第二是对特定菌株有一定局限性，对于细胞壁较厚的如真菌、结核分枝杆菌等，核酸提取效率较低，导致检出率、序列数、敏感性均偏低，且需要临床医生根据检测出的序列数及相对丰度结合临床表现及特异性实验室结果等共同解读。第三是从样本中识别核酸序列，只能通过现有数据库分析是否具有耐药基因，有不能进行药敏试验的缺点。第四是目前多项回顾性研究 [22] [29] [30] 认为不加选择地应用mNGS检测的临床影响有限。而具有明确定义的深部感染的免疫功能低下的患者可能从检测中受益最多，需要进一步的研究如更大样本量的研究、前瞻性、比较研究来评估mNGS测试对其有影响的所有临床场景，提高性价比的同时规范临床应用。第五是目前国内外对于呼吸道 [31]、血流感染 [32]、重症感染 [33] 及特殊人群 [34] [35] [36] 感染等应用mNGS有相关的初步指南，但对于泌尿道、消化道感染方面，国内外缺乏此类文献。尿液mNGS对泌尿系统感染疾病及引起急性肾损伤病因诊断具有一定参考价值。目前临床相关文献较少，也无相关专家共识，是研究的薄弱领域。

5. 展望

mNGS的出现使病原体检测进入基因信息化时代，目前国内外有限的研究和病例报道证明了此项技术的潜力。随着技术成本的降低、病原体序列数据库的扩大和数据分析工具的改进，临床微生物实验室使用mNGS的许多局限性正在被克服。上述多项研究均表明mNGS在临床症状不典型或常规检查不能明确或者怀疑混合感染，以及患者情况危急，需要快速全面的检测结果时，可能会表现出更好的性价比。诊断性mNGS倾向于在未来十年发挥越来越重要的作用。

NOTES

^*通讯作者。