1. 引言
蛭类，系环节动物门(Annelida)蛭纲(Hirudinea)的统称，全球范围内已知蛭类700余种，我国已知蛭类2亚纲3目9科37属118种，约占世界蛭类物种数的1/6 [1] 。传统上，根据栖息环境的不同，将蛭类区分为“水蛭”和“陆蛭”。Sawyer对陆蛭进行归类整理，将其统归为山蛭科，包括3颚类组(trignathous) 5属和2颚类组(duognathous) 12属 [2] 。之后，3颚类组又相继被修订为3属，即三颚四环蛭属(Tritetrabdella)、山蛭属(Haemadipsa) [3] [4] 和中国洞蛭属(Sinospelaeobdella) [5] 。
中国洞蛭属目前仅发现2种，即洞穴山蛭(Haemadipsa cavatuses) [6] 和武陵洞蛭(Sinospelaeobdella wulingensis) [5] ，武陵洞蛭是该属的模式种，目前已知仅分布于湘西州境内的少数几个溶洞中 [5] 和四川省邻水县的老龙洞 [7] ，而洞穴山蛭仅分布于云南西陲德宏自治州境内的个别溶洞中 [6] [8] ，其学名已修订为Sinospelaeobdella cavatuses [5] 。
贵州省地处我国西南腹地，与重庆、四川、云南、广西和湖南接壤，境内以喀斯特地貌为主，溶洞众多，洞穴动物资源非常丰富 [9] [10] [11] ，但迄今未见有关该省洞穴蛭类的专题研究报道。近年，我们在贵州省遵义市进行洞穴动物资源调查时，在务川县马福林保护区的一个溶洞的顶壁采集到一种陆生蛭类，经形态学比较观察和分子分析，将其鉴定为武陵洞蛭，系该种在贵州省境内的首次记录，从而使武陵洞蛭已知的分布范围扩展到贵州省，为该属种动物地理与演化的深入研究提供了基础资料。
2. 材料与方法
2.1. 样品采集及形态特征观察
2019年3月，项目组在贵州省务川县云丰村简家沟的一个溶洞(28.3423˚N, 107.755˚E)深处(离洞口约250 m)的洞道顶壁采集到2条洞蛭，分别编号为GZ20190302001和GZ20190302002。将活体标本装于矿泉水瓶内，瓶口用两层纱布封盖以保证瓶内通气。标本带回实验室后，先进行活体外形特征观察。然后参照《中国动物志·环节动物门·蛭纲) [12] 中介绍的方法，使用数显式游标卡尺(精度0.01 mm)对其进行观察和测量，主要指标包括体长、体宽、头宽、尾吸盘直径、口吸盘直径；颚的数量；眼点的数量、分布模式及形状；生殖孔的位置；尾吸盘的形状及辐射肋的数量；耳状突的形状和数量等。标本保存在吉首大学生物资源与环境科学学院动物标本室。
2.2. DNA提取、扩增与测序
剪取上述标本的一小部分后吸盘，采用生工生物工程(上海)股份有限公司(简称“生工生物”)提供的Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒(B518251)提取基因组DNA，使用蛭类通用引物LCO1490/HCO2198进行线粒体COI基因扩增 [13] ，PCR反应体系的总体积为25 µL，其中包括1 μL模板DNA、12.5 μL的Taq PCR master Mix (Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR Buffer、PCR稳定剂、载凝胶剂和蓝色染料)、9.5 μL的ddH2O、2 µL 10 µmol/L的引物。扩增COI基因的PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，49℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环30次，最后72℃总延伸10 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，选取条带清晰明亮的PCR产物寄送至生工生物进行纯化后测序。
2.3. 数据处理
采用EXCEL软件对洞蛭的外部形态特征数据进行统计分析。
对于测序结果，利用DNAstar lasergene 7.1.0软件对拼接序列进行编辑校正。然后在NCBI上运行Blast程序，进行比较确认，下载部分亲缘关系较近的蛭类序列进行序列比对，使用MEGA11.0计算修正后的序列间的遗传距离，以邻接法(neighbor-joining, NJ)构建系统发育树，进化树的各分支置信度采用1000次的自检分析进行重复检验。
综合形态学特征与分子数据的比较研究，对标本进行物种鉴定。
3. 结果与分析
3.1. 形态特征
该洞蛭标本体型中等，呈长圆锥状，体表缺乏色素，因此可见到体内所贮存的宿主的血液(图1)。酒精浸泡后，标本呈现乳白色，无条纹；体长分别为17.32 mm和22.66 mm，最大体宽为4.27 mm和4.53 mm；头宽为2.30 mm和2.76 mm；尾吸盘近圆形，直径为4.87 mm和6.10 mm，超过最大体宽(表1)。
Figure 1. The leeches living on the celling of Jianjiagou Karstic Cave in Mafulin Nature Reserve, Wuchuan, Guizhou. Note: The visible body color is not surface one, but mainly that of host blood stored in their bodies
图1. 栖息在贵州务川马福林保护区简家沟溶洞顶壁的蛭体。注：所见体色并非体表颜色，而主要是体内所贮存的宿主的血液的颜色
全身共有27体节94体环，完全体节具5体环；眼点5对，依次分别位于第2、3、4、5、8体环的两侧，呈半圆弧形排列，第1、2、3对眼点呈弧形，第2对最大，第4、5对呈点状，第5对眼点无缺失现象。雌、雄生殖孔分别位于第35/36体环和第33/34体环的腹面环沟上(表1)；雌、雄生殖孔相隔2体环(图2(a))。肛门开口于正背面第94体环与尾吸盘的交界处，在背部与尾吸盘交界处的左右两侧有三对大小相当并呈三角形的耳状突(叶) (图2(b))。
Table 1. Comparison of morphological characteristics among the cave leech specimens from Guizhou and two known species of Sinospelaeobdella
表1. 贵州洞蛭标本与中国洞蛭属已知的两个物种之间的形态特征比较
Figure 2. Partial external morphological characteristics of cave leech specimens from Guizhou. (a) Positions of gonopores: ♂ male gonopore, ♀ female gonopore; (b) dorsal view of posterior sucker: an: anus, au: auricle, cs: caudal sucker (The specimens preserved in 95% alcohol before photographing)
图2. 贵州洞蛭标本的局部外形特征。(a) 雌、雄生殖孔的位置：♂为雄性生殖孔，♀为雌性生殖孔；(b) 尾吸盘背面观：an：肛门，au：耳状突，cs：尾吸盘(观察拍照前，标本保存于95%的酒精溶液中)
3.2. 分子鉴定
分子数据经过处理，获得线粒体COI基因序列长度658 bp。通过NCBI Blast检测，贵州标本与武陵洞蛭的相似度高达98.49%，与洞穴山蛭的相似度为90.29%。基于线粒体COI基因构建的系统发育树显示，贵州标本与分布于湖南湘西州的武陵洞蛭聚为一个支系，而洞穴山蛭单独形成另一个支系(图3)。遗传距离分析显示，贵州标本与模式产地的武陵洞蛭平均相差1.16%，与四川的武陵洞蛭相差4.7%，与洞穴山蛭平均相差10.18% (表2)。据此，我们将贵州的洞蛭标本鉴定为武陵洞蛭。
Figure 3. Neighbor-joining (NJ) tree based on the sequences of mitochondrial COI gene. The number on the tree indicated bootstrap value; Sinospelaeobdella sp.GZWC indicated the No. of the specimen from Guizhou
图3. 基于线粒体COI基因构建的NJ树。各分支上的数字表示节点支持率；Sinospelaeobdella sp.GZWC为贵州标本
Table 2. The uncorrected pairwise genetic distances in the Sinocavebdella based on COI gene
表2. 基于COI基因计算的中国洞蛭属种内及种间的遗传距离
注：S.sp.GZWC：贵州务川洞蛭；S.wu：武陵洞蛭；S.ca：洞穴山蛭。
4. 讨论
贵州省务川县简家沟洞蛭标本的体表缺乏色素，完全体节数为5环，生殖孔间隔2环等特征与中国洞蛭属 [5] 的鉴别特征相符。与该属目前已知的武陵洞蛭和洞穴山蛭 [5] [6] 两种相比较，其体型中等、眼点第2对最大且第5对眼点无缺失现象等特征区别于后者，而更接近于前者。同时，构建的系统发育树也显示，贵州标本与武陵洞蛭聚为一支。因此，将贵州洞蛭标本鉴定为武陵洞蛭。可是，贵州标本与模式产地的武陵洞蛭标本也存在一些差异，如耳状突前者明显大于后者，究其原因，一方面可能是该特征在不同地理种群之间变异较大，另一方面则可能是观察标本较少或不同的标本保存方式造成的差异。
四川标本采集地和武陵洞蛭模式产地的直线距离约为350 km，平均遗传距离相差4.5% [7] ；贵州标本采集地与四川标本采集地之间的直线距离约为230 km，遗传距离相差4.7%，而贵州标本采集地与武陵洞蛭模式产地的空间距离约为190 km，平均遗传距离仅相差1.16%，这表明武陵洞蛭贵州种群与模式产地种群之间可能存在更为频繁的基因交流。因此，在今后的研究中，洞蛭种群之间的交流模式以及是否可能存在亚种分化值得关注。
5. 结论
该务川洞蛭标本的形态结构与武陵洞蛭较为相似，通过线粒体COI基因分析，该洞蛭与武陵洞蛭的亲缘关系较近。因此，综合形态学特征观察和COI基因序列比较，将采自贵州省务川县云丰村简家沟溶洞中的陆生蛭种鉴定为武陵洞蛭(Sinospelaeobdella wulingensis)，系贵州省环节动物门蛭纲的新记录，为该属种动物地理及类群演化的深入研究提供了新的资料。
基金项目
研究过程中，得到国家自然科学基金项目(32160241)、国家自然科学基金重点国际(地区)合作与交流项目(31961123003)委托子项目、湖南省自然科学基金项目(2021JJ30554)的经费支持，以及贵州省遵义市务川县马福林保护区张显武副局长、其他工作人员及周边群众的热情帮助，还得到中南林业科技大学张志强博士的支持，谨此一并致谢！
NOTES
*通讯作者。