基于网络药理学探讨辣椒抗乳腺癌的潜在机制

Exploring the Potential Mechanism of Capsicum against Breast Cancer Based on Network Pharmacology

摘要: 目的：基于网络药理学探讨辣椒抗乳腺癌的潜在作用机制。方法：在TCMSP数据库中筛选辣椒的活性化合物；利用PubChem和SwissTargetPrediction预测辣椒活性化合物的靶点基因；利用Genecards和OMIM数据库筛选疾病的靶点；利用Cytoscape 3.9.1软件构建药物–成分–靶点的可视化网络；通过STRING数据库对关键靶点构建蛋白质相互作用(PPI)网络；利用David数据库进行GO功能以及KEGG通路富集分析。结果：辣椒活性化合物共14个，药物靶点基因为270个；乳腺癌疾病靶点基因1280个；辣椒–乳腺癌共同靶点基因76个；KEGG通路富集分析显示辣椒可参与调控与乳腺癌相关的多条通路，包括P13K-AKT信号通路、HIF-1信号通路、Fox0信号通路以及Prolactin信号通路等肿瘤经典通路。结论：辣椒可能通过多个靶点、多个通路发挥抗乳腺癌的作用。

Abstract: Objective: To investigate the potential mechanism of capsicum against breast cancer based on network pharmacology. Methods: The active compounds of capsicum were screened in the TCMSP database; PubChem and SwissTargetPrediction were used to predict target genes of active compounds in capsicum; Screening targets for disease using the Genecards and OMIM databases; Cytoscape 3.9.1 software was used to build a drug-component-target visualization network; Protein interaction (PPI) networks were constructed for key targets through the STRING database; The David database was used for GO functionality and KEGG pathway enrichment analysis. Results: There were 14 active compounds in capsicum pepper, and 270 drug target genes. 1280 breast cancer disease target genes; 76 capsicum-breast cancer co-target genes; KEGG pathway enrichment analysis showed that pepper can participate in the regulation of multiple pathways related to breast cancer, including P13K-AKT signaling pathway, HIF-1 signaling pathway, Fox0 signaling pathway, and Prolactin signaling pathway and other tumor classical pathways. Conclusion: Capsicum may exert anti-breast cancer effects through multiple targets and multiple pathways.

1. 引言

乳腺癌(Breast Cancer)发病率居所有女性恶性肿瘤首位 [1] 。世界卫生组织国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC)发布了2020年全球最新癌症负担数据，乳腺癌已经正式取代肺癌，成为“全球第一大癌症” [2] [3] 。乳腺癌的发病机制复杂，涉及BRCA/TP53/PTEN等基因突变、电离辐射、致癌通路活化以及妊娠等多个因素 [4] [5] [6] [7] [8] 。越来越多的研究表明，包括饮食在内的不良膳食模式和饮食习惯，可以增加乳腺癌的患病风险 [9] [10] ，而合理的饮食模式有利于减少乳腺癌的发生 [11] 。

目前，辣椒(Capsicum Annuum, Hot Pepper, Chili Pepper)制品广泛见于全球不同文化的各种食品中 [12] ，被当作食用蔬菜、调味品、天然着色剂和传统药物使用。近年来，在辛辣饮食文化快速传播、地域不断扩大的推动下，国内辣椒消费始终保持快速增长 [13] 。辣椒是最常规食用且肿瘤患者关注度最高的忌食物类别 [14] ，因此，关于辣椒的研究也日益增多。

现代研究表明，辣椒中富含有利于健康的多种化合物，如维生素、矿物质、类黄酮、类胡萝卜素、辣椒素、辣椒二氢碱以及色素(包括叶绿素、花青素和叶黄素) [15] 。辣椒作用广泛，现代药理研究表明其中的胡萝卜素由辣椒红素和辣椒素组成，具有抗氧化特性 [16] 。辣椒素是辣椒中的主要活性化合物，可以产生刺激性味道，具有抗氧化、抗炎、抗肥胖 [17] 、心脏保护和代谢调节作用。同时，辣椒素也是一种潜在的抗肿瘤化合物 [18] ，在乳腺癌 [19] 、肝癌 [20] 、胃肠道癌症 [21] 、非小细胞肺癌 [22] 等恶性肿瘤中发挥作用。毛岸云等 [23] 研究证明辣椒碱可以显著抑制人乳腺癌细胞MCF-7细胞的迁移和侵袭能力，其机制可能与下调细胞中沉默信息调节因子2同源蛋白1 (SIRT1) mRNA和蛋白的表达水平DNA聚合酶δ催化亚基p125的编码基因(POLD1) mRNA和DNA聚合酶δ催化亚基(p125)的蛋白表达水平有关。陈茂剑等人 [24] 研究发现辣椒碱对乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠移植瘤生长具有明显的移植作用，其机制可能与下调高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)和Toll样受体4 (TLR4)蛋白表达有关。Eliana等 [25] 研究发现辣椒中的果胶多糖在乳腺肿瘤谱系中的埃利希肿瘤(Enrlich tumor)中发挥抗肿瘤作用，其抗肿瘤作用可能与炎症以及血管生成的调节相关。

但是，辣椒中的有效成分众多，相互作用机制复杂，其在对抗乳腺癌中的分子机制尚未被完全阐明。因此本研究试图通过运用网络药理学技术 [26] 以及辣椒治疗乳腺癌的临床经验，预测辣椒作用于乳腺癌的核心成分以及核心靶点，为进一步的辣椒治疗乳腺癌机制研究和临床研究提供依据。

2. 材料与方法

2.1. 数据库与软件

中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP) (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、Genecards (https://www.genecards.org/)、有机小分子生物活性数据库PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、小分子药物靶点预测在线平台SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)、人类在线孟德尔遗传数据库(0nline Mendelian Inheritance in Man, OMIM) (https://omim.org/)、人类基因综合数据库Genecards (https://www.genecards.org/)、蛋白质相互作用数据库(Search Tool for the Retrieval of Interaction Gene/Proteins, STRING) (https://cn.string-db.org/)、生物信息数据库(The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, DAVID) (https://david.ncifcrf.gov/)、文氏图(Venn diagram, Venn) (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)、微生信(https://www.bioinformatics.com.cn/)、Cytoscape 3.9.1。

2.2. 辣椒活性化合物及靶点的获取

在TCMSP数据库中，输入“辣椒”获得辣椒的成分，良好的口服生物利用度(Oral Bioavailability, OB)以及类药性(Drug-Likeness, DL)是化合物发展成为药物的前提 [27] ，以OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18为标准对化合物进行筛选，得到辣椒的活性成分。在PubChem数据库中输入辣椒活性成分名称，获得Canonical SMILES号。在SwissTargetPrediction输入活性成分的Canonical SMILES号，限定物种为“Homo sapiens”，进行靶点预测，下载保存为CSV格式。

2.3. 乳腺癌疾病靶点及辣椒–乳腺癌共同靶点的获取

查阅相关文献后，以“breast cancer”、“mammary cancer”为关键词从Genecards、OMIM数据库提取乳腺癌相关基因，将上述数据库的靶点合并后删除重复值，按照相关性分数进行筛选。将辣椒活性化合物的作用靶点与乳腺癌相关作用靶点导入在线网站Venny 2.1，绘制Venn图，筛选出辣椒–乳腺癌共同靶点。

2.4. “药物–成分–靶点”网络的构建

将筛选得到的药物活性成分，药物与疾病交集靶点等信息输入Cytoscape 3.9.1软件，构建“药物–成分–靶点”网络，运用Cytoscape软件中的“CytoNCA”功能分析其拓扑学属性，导出度中心性(Degree Centrality, DC)等参数。

2.5. 关键靶点蛋白相互作用网络(PPI)的构建

将筛选出的共同靶点导入STRING数据库，选择置信度 > 0.4，构建PPI网络图，并导出tsv文件。使用Cytoscape 3.9.1软件分析PPI结果，运用“CytoNCA”功能分析其拓扑学属性，依据Degree值筛选出核心靶点。

2.6. 基因本体(GO)富集分析和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

使用DAVID数据库对交集基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。选取GO分析结果中富集程度最高的前10条以及KEGG分析结果中富集程度最高的前10条通路，绘制富集气泡图。

3. 结果

3.1. 辣椒活性化合物及靶点的获取

在TCMSP数据库中获得辣椒化学成分222个，按照OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18的条件进行筛选，获取辣椒的活性化合物为14个(见表1)，获得各活性化合物的靶点基因共有270个。

Table 1. Actice ingredients of Capsicum

表1. 辣椒活性化合物信息

3.2. 乳腺癌疾病靶点及辣椒–乳腺癌共同靶点的获取

在Genecards、OMIM数据库以“breast cancer”、“mammary cancer”为关键词进行搜索，分别获得乳腺癌相关靶点基因39,467、248，将上述数据库的靶点合并后删除重复值，按照相关性分数进行筛选，获得乳腺癌疾病相关靶点基因共有1280个。将辣椒活性化合物的作用靶点与乳腺癌相关作用靶点导入在线网站Venny 2.1，筛选出辣椒–乳腺癌共同靶点共76个，并绘制Venn图(见图1)。

Figure 1. Capsicum-breast cancer common targets (Venn)

图1. 辣椒–乳腺癌共同靶点Venn图

3.3. “药物–成分–靶点”网络的构建

将获取的辣椒的14个活性化合物与76个药物–疾病共同靶点输入到Cytoscape 3.9.1软件中，绘制“药物–成分–靶点”网络图(见图2)。

Figure 2. Network diagram of “drug-components-targets” interactions

图2. “药物–成分–靶点”相互作用的网络图

3.4. PPI网络的构建以及筛选核心靶点

将辣椒–乳腺癌的76个交集基因导入STRING数据库，选择置信度 > 0.4，构建PPI网络图，并导出tsv文件。使用Cytoscape 3.9.1软件分析PPI结果，依据Degree值筛选出前10位的核心靶点(见图3)。

Figure 3. Core target and PPI network of Capsicum in treating breast cancer

图3. PPI网络构建及核心靶点的筛选过程图

3.5. 基因本体(GO)富集分析和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

将76个辣椒–乳腺癌交集靶点基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析包括生物学过程(Biological Process, BP)、细胞组成(Celluar Component, CC)以及分子功能(Molecular Function, MF)，设定p < 0.05，一共富集到528个条目，其中生物学过程381条，细胞组成50条，分子功能97条，按照p值大小排序取前10位进行富集分析，绘制富集气泡图(见图4)。图中，横坐标是富集倍数(Fold Enrichment)，纵坐标是GO名称，圆圈大小代表着富集在GO上基因的数目，圆圈颜色则代表富集的显著性，颜色越红，则代表基因在GO上富集的越显著。同时进行KEGG通路富集分析，设定p < 0.05，一共富集到144条通路，按照p值大小排序取前20位进行富集分析，绘制富集气泡图(见图5)。

Figure 4. GO function enrichment analysis of targets of Capsicum in treating breast cancer

图4. 辣椒治疗乳腺癌的GO富集分析

Figure 5. KEGG pathway enrichment analysis of targets of capsicum in treating breast cancer

图5. 辣椒治疗乳腺癌的KEGG通路富集分析

4. 讨论

乳腺癌是一种常见的女性恶性肿瘤，起病隐秘，大多数情况下是在体检或者偶然触摸时发现。目前，对于乳腺癌的认识日益加深，主要治疗手段包括外科手术、放射疗法、化疗、内分泌治疗以及免疫治疗 [28] 。但是，外科手术治疗后出现的术后并发症以及放化疗治疗后出现的不良反应 [29] [30] 是乳腺癌治疗中亟待解决的问题。祖国传统医学中并没有“乳腺癌”病名的记载，在古籍里称为“乳岩”、“乳石痈”、“妒乳”等 [31] [32] 。《青囊秘诀》中说到：乳岩乃忿怒所酿，忧郁所积，多疑多忌，失于调理，则厥阴不畅，阳明亢进 [33] ，可知乳腺癌的发病与情志不畅密切相关。而辣椒具有温中下气、散寒除湿、开郁祛痰的功效。既往研究证实膳食模式和饮食习惯与乳腺癌的发生存在相关性 [34] [35] [36] 。部分研究已经证实辣椒对于乳腺癌的发生发展存在一定的影响 [23] [24] [37] ，但目前机制尚不完全清楚。因此，本研究试图基于网络药理学方法，探究辣椒作用于乳腺癌的有效活性成分、靶点以及信号通路，为辣椒治疗乳腺癌进一步的机制研究和临床应用提供参考。

网络药理学研究结果提示，辣椒的活性化合物14个、辣椒–乳腺癌共同靶点基因76个，筛选后得到排名前5的活性化合物为辣椒素、辣椒二氢碱、隐黄素、辣椒玉红素以及胆甾醇。陈茂建等人 [38] 实验表明，免疫缺陷病毒短转录诱导物连接因子-1 (FBI-1)作为一种原癌基因，负调节许多肿瘤抑制基因的转录，在肿瘤的发生发展中起到重要作用，结果提示FBI-1与辣椒素诱导的乳腺癌的抗增殖和促凋亡有关，潜在机制可能是与FBI-1介导的NF-κB通路下调有关。李伯和等 [39] 研究发现，低浓度的辣椒二氢碱可以剂量依赖性地抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移和侵袭，潜在机制可能涉及辣椒碱对c-Src/FAK/Paxillin信号通路的抑制。

PPI网络分析后发现辣椒的核心靶点基因有肿瘤蛋白P53 (TP53)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1 (AKT1)、细胞周期素D1重组蛋白(CCND1)、人雌激素受体α (ESR1)以及丝裂原活化蛋白激酶3 (MAPK3)。KEGG富集分析结果提示辣椒可参与调控与乳腺癌相关的多条通路，包括P13K-AKT信号通路、HIF-1信号通路、Fox0信号通路以及Prolactin信号通路等经典通路。其中，AKT1是P13K-AKT信号通路的关键下游靶点，与KEGG通路富集分析结果一致。Li等 [40] 研究报道了抑制P13K/AKT/mTOR通路诱导氧化应激介导的人乳腺癌MCF-7细胞凋亡和自噬。Wu等人 [5] 研究发现，磷酸酶和张力素同系物(PTEN)在乳腺癌细胞中经常发生突变或者缺失，而这与P13K/AKT信号通路有关，而PTEN的过表达可以诱导细胞凋亡并且防止乳腺癌细胞增殖。

综上，本文借助网络药理学的研究方法，探究得出辣椒具有多活性成分、多核心靶点以及多信号通路的特征。结合PPI网络分析以及KEGG通路富集分析结果，辣椒可能通过P13K/AKT信号通路发挥抗乳腺癌的作用。本研究预测了辣椒抗乳腺癌的活性化合物、靶点基因和通路，为后续进一步研究辣椒抗乳腺癌提供依据。但是，本研究还存在研究局限性：第一，限制了筛选条件，仅仅筛选辣椒的有效活性化合物以及对主要作用靶点进行预测；第二，虽然借助网络药理学的研究方法，对辣椒作用于乳腺癌的活性成分、核心靶点以及信号通路进行了预测，但是仍需要进一步的体内体外实验验证。