1. 引言
马兜铃属植物因其普遍含有马兜铃酸(Aristolochic Acids, AAs)而得名，作为中草药广泛参与临床疾病的治疗 [1] 。常见的马兜铃属中草药有马兜铃、细辛、关木通、广防己等 [2] 。AAs是一类硝基菲羧酸类化合物，也是马兜铃属中草药的主要活性成分，其占比最多的是马兜铃酸I (aristolochic acid I)和AAII (aristolochic acid II) [3] 。通过对马兜铃属中草药临床应用的研究，发现其对肾脏有广泛的毒性作用，1964年我国吴松寒就已发现大量服用木通会导致急性肾损伤；90年代初，比利时出现了百余名妇女的中毒事件，调查显示其“罪魁祸首”是服用了含有广防己的减肥方；1990年我国也出现了服用含有关木通的龙胆泻肝丸的群体性药害事件 [4] [5] [6] 。研究表明，单次摄入或多次摄入AAs均会导致以进展性肾纤维化和肾衰竭为特征的马兜铃酸肾病(Aristolochic Acid Nephropathy, AAN) [7] 。没有及时地停用药物，进行干预治疗，会引起肾脏的不可逆性损伤，发展成为慢性肾脏病，晚期只能通过透析、肾移植等肾脏替代治疗维持生命，采用这类治疗方法的患者治疗费用高，生活质量差，给病人带来极大的痛苦 [8] 。
Wnt/β-catenin信号通路是一类进化过程中高度保守的信号通路，参与发育和疾病过程，目前在哺乳动物体内发现了19种Wnt配体和15种受体及共受体 [9] 。Wnt/β-catenin信号通路在体内的传导过程是通过Wnt蛋白与受体Frizzled家族蛋白和LRP5/6受体结合，导致GSK3β的失活并阻止破坏复合体的组装，抑制β-catenin在胞质内的降解，引起β-catenin在胞质内积累并转运到细胞核，在核内β-catenin与T细胞因子(TCF)和淋巴增强因子(LEF)结合并启动以SNAIL1和ZEB1为代表的Wnt靶基因的表达 [10] 。本研究通过观察青木香与AAI造成的慢性AAN以及发展过程中Wnt/β-catenin信号通路的变化，探讨慢性AAN的病理变化和Wnt/β-catenin信号通路在AAN纤维化发展过程中的作用机制，为阐明AAN纤维化的机制和发展其临床治疗手段提供了参考。
2. 材料与方法
2.1. 药物、试剂及仪器
将AAI标准品(纯度96%，批号：211109M，四川维克奇生物)，溶于二甲基亚砜(批号：814O036，北京索莱宝科技)与0.4%的羧甲基纤维素钠(Carboxymethylcellulose Sodium, CMC-Na) (批号：20201203，上海展云化工)中，制成2 mg/mL的AAI悬浊液。青木香(购自亳州中药材批发市场)用甲醇萃取、旋蒸，用0.4%的羧甲基纤维素钠进行复溶，得到AAI含量为2 mg/mL的青木香悬浊液。HE染色液(批号：20201104，北京索莱宝)；Masson染色试剂盒(批号：20210428，北京索莱宝)；β-连环蛋白(β-catenin)鼠多克隆抗体(批号：00100092，武汉三鹰生物)；α平滑肌肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin, α-SMA)兔多克隆抗体(批号：PA1-26204，Thermo Fisher scientific公司)；免疫组化(Immunohistochemistry, IHC) SP试剂盒(批号：2222B301，北京中杉金桥)；DAB显色试剂盒(批号：20220718，北京兰杰柯科技有限公司) DMIL LED DFC425c型显微镜(徕卡)。
2.2. 实验动物
8周龄的雄性KM小鼠36只，体重(32 ± 5) g，在贵州中医药大学基础医学院实验动物中心饲养，常温环境，自由摄食、饮水。实验过程严格按照《实验动物福利伦理审查指南(GB/T35922018)》要求执行。
2.3. 动物分组及给药
将36只小鼠于笼中适应性喂养一周，自由进食水。随机分为3组，对照组、AAI组和青木香组，每组12只。对照组小鼠灌胃给药0.4% CMC 0.2 mL/2d，AAI组小鼠灌胃给药5 mg/kg/2d，青木香组小鼠灌胃给药青木香悬浊液5 mg/kg/2d。
2.4. 样本采集
用药开始后将对照组和模型组的小鼠分别于第4周和第8周各随机取6只，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，摘眼球取血后，颈椎脱臼处死，用PBS进行灌注，取出肾组织样本，沿矢状面分为两份，PBS冲洗后浸入4%多聚甲醛固定。
2.5. 组织病理学染色
将固定过的肾脏组织经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋后切片(厚度3 µm)，进行苏木精–伊红(HE)与Masson染色，在光学显微镜下观察肾脏组织病理变化。
2.6. 免疫组化染色
将玻片放入60℃烤箱2个小时融化切片表面石蜡，放入二甲苯I、II、III各10 min，再用梯度乙醇进行脱水，置于PBS缓冲液中浸洗。用柠檬酸钠抗原修复液高温修复，滴加内源性过氧化物酶阻断剂(3% H2O2)，室温孵育10 min，用PBS缓冲液浸洗3次。滴加100 μL山羊血清封闭液，室温孵育15 min，β-catenin抗体(1:200)，α-SMA抗体(1:200)稀释，滴加100 μL，放入免疫组化孵育盒，4℃过夜，用PBS缓冲液浸洗。滴加100 μL生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG抗体，室温孵育15 min，用PBS缓冲液浸洗。滴加100 μL辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15 min，用PBS缓冲液浸洗。滴加新鲜配制的DAB显色液，室温孵育1~3 min，在镜下观察到阳性反应立即终止反应。用自来水冲洗玻片。苏木素复染。梯度脱水，依次放入二甲苯I、二甲苯II 5 min，中性树脂胶封片，光学显微镜下观察蛋白表达情况。
2.7. 数据分析与处理
免疫组化和Masson染色的图像使用ImageJ软件对阳性染色部位进行统计 [11] ，实验结果以SPSS 24.0软件进行统计分析，数据均以
± s表示，多组间统计学差异(方差齐性检验后)采用单因素方差分析(one-way-AVOVA)比较；P < 0.05表示差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. 青木香与AAI对小鼠肾脏的毒性
通过HE染色观察慢性AAN的病理改变。结果显示与对照组相比，小鼠暴露于AAI和青木香4周后肾皮质形态结构紊乱，可见肾小管管腔扩张，部分肾小管上皮细胞出现刷状缘消失、细胞坏死脱落等改变，另外有少量肾小管上皮细胞表现为胞质浓染、细胞核增大等表现，肾小球未出现明显改变；暴露于AAI和青木香8周后肾小管管腔扩张数量较4周比增多，肾小管上皮细胞也出现了水肿、坏死和脱落，同时也出现了犬牙状分布的胞质浓染、细胞核增大的肾小管上皮细胞(见图1)。
小鼠暴露于AAI与青木香4周与8周后肾脏病理改变的代表性图片。暴露于AAI与青木香后肾近曲小管上皮细胞出现水肿、脱落坏死，部分上皮细胞胞质浓染，呈犬牙状分布。
Figure 1. Kidney changes in mice exposed to AAI and cyanobacteria for 4 and 8 weeks after HE staining
图1. HE染色观察小鼠暴露于AAI与青木香4周与8周后肾脏的变化
3.2. 慢性AAN过程中Wnt/β-Catenin信号通路的改变
通过免疫组化观察小鼠暴露于AAI和青木香后肾脏中的β-catenin蛋白表达情况。结果显示，对照组的β-catenin蛋白免疫组化平均光密度值在4周和8周时变化不大。与对照组相比，小鼠暴露于AAI和青木香4周后肾小管中β-catenin表达增高，为对照组的1.2倍，主要聚集在肾小管上皮细胞的细胞质和细胞核内；与对照组相比，小鼠暴露于AAI和青木香8周后，β-catenin蛋白的表达进一步增高，为对照组的1.4倍，大量聚集在肾小管上皮细胞的细胞核内(见图2)。
小鼠暴露于AAI与青木香4周与8周后肾脏β-catenin蛋白表达的代表性图片。对照组未出现明显的β-catenin蛋白的表达，暴露于AAI与青木香4周后肾近曲小管上皮细胞胞质和细胞核内出现β-catenin蛋白的表达，8周后β-catenin蛋白的表达进一步聚集于细胞核内；β-catenin免疫组化平均光密度值与对照组相比有明显升高。n = 5，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.005。
Figure 2. Changes in renal β-catenin protein expression in mice exposed to AAI and cyanobacteria for 4 and 8 weeks after immunohistochemical staining
图2. 免疫组化染色观察小鼠暴露于AAI与青木香4周与8周后肾脏β-catenin蛋白的表达变化
3.3. Wnt/β-Catenin信号通路与肾纤维化
通过Masson染色观察小鼠暴露于AAI和青木香后肾脏胶原纤维的改变。结果显示，与对照组相比，小鼠暴露于AAI和青木香4周后蓝染的胶原纤维数量和面积明显增多，通过对染色结果的胶原纤维容积分数进行统计分析后发现，AAI组和青木香组的胶原纤维容积分数显著增加；与对照组相比，小鼠暴露于AAI和青木香8周后肾皮质中的纤维数量和胶原纤维容积分数也出现了显著增加(见图3)。
小鼠暴露于AAI与青木香4周与8周后肾皮质Masson染色的代表性图片。暴露于AAI与青木香4周和8周后，肾皮质胶原纤维的表达增多；与对照相比，胶原纤维容积分数出现了显著增高。n = 5，*P < 0.05；**P < 0.01。
Figure 3. Change in collagen fiber expression in renal cortex of mice exposed to AAI and cyanobacteria for 4 and 8 weeks after Masson staining
图3. Masson染色观察小鼠暴露于AAI与青木香4周与8周后肾皮质胶原纤维的表达变化
通过免疫组化对暴露于AAI和青木香小鼠肾脏的α-SMA蛋白表达进行观察，结果显示，小鼠暴露于AAI和青木香4周后，与对照组相比，α-SMA蛋白的表达明显增高，聚集在犬牙状细胞内，为对照组的1.4倍以上；与对照组相比，小鼠暴露于AAI和青木香8周后，AAI组的α-SMA蛋白的表达超过对照组的1.6倍，青木香组也较对照组有明显的升高(见图4)。
小鼠暴露于AAI与青木香4周与8周后肾脏α-SMA蛋白表达的代表性图片。对照组没有明显的α-SMA蛋白表达，暴露于AAI与青木香后肾近曲小管上皮细胞表达α-SMA蛋白；β-catenin免疫组化平均光密度值与对照组相比有明显升高。n = 5，*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.005。
Figure 4. Changes in renal α-SMA protein expression in mice exposed to AAI and cyanobacteria for 4 and 8 weeks after immunohistochemical staining
图4. 免疫组化染色观察小鼠暴露于AAI与青木香4周与8周后肾脏α-SMA蛋白的表达变化
4. 讨论
青木香作为马兜铃属植物，在我国分布广泛，曾作为中草药和民族药入药 [1] 。研究表明，马兜铃属植物的毒性大部分源于其富含的AAI，主要损伤肾脏的肾小管尤其是肾近端小管，会引起近端小管上皮细胞坏死、脱落，进一步诱导肾小管上皮细胞纤维化 [12] 。因此，明确AAN过程中纤维化的改变和与Wnt/β-catenin信号通路之间的关系对于AAN的诊断和治疗有重要意义。
小鼠暴露于AAI与青木香4周以及8周后，大量肾小管管腔扩张，肾小管上皮细胞出现不同程度的损伤，细胞核固缩，还出现了部分另一种形态的肾小管上皮细胞，细胞呈犬牙状突起，胞质浓染，细胞核增大，与损伤后新生的肾小管上皮细胞形态一致 [13] 。说明AAI对肾脏有毒性作用，主要损伤肾小管上皮细胞，在慢性AAN的发展过程中，受损的肾小管上皮细胞出现自我修复，会有新生的肾小管上皮细胞的出现。而暴露于AAI和暴露于青木香后小鼠的病理改变表现相同，证明了AAI是引发AAN的主要毒性成分。
研究表明，慢性期的AAN会诱发肾小管尤其是近端肾小管上皮细胞坏死、脱落，并诱发肾小管上皮细胞EMT进而引发纤维化，也是马兜铃酸肾病预后不佳的重要原因，其引发纤维化的机制尚不明确 [14] 。而Wnt/β-catenin信号通路被发现参与了肾脏的疾病过程，在不同层面上干扰Wnt通路，如在输尿管阻塞小鼠肾间质纤维化模型中注射Ddk1 (一种Wnt拮抗剂)载体可以减少β-catenin的积聚和纤维化 [15] ；另一种Wnt拮抗剂Dapper3的缺失会导致输尿管梗阻肾纤维化动物模型β-catenin的紊乱、Wnt靶向的促纤维化基因的激活和纤维化表型的恶化 [16] 。这些结果都表明，Wnt信号通路与肾间质纤维化关系密切，在肾间质纤维化过程中发挥着重要作用。我们通过对Wnt/β-catenin信号通路的核心蛋白β-catenin的免疫组化研究发现，在慢性AAN发展的过程中，β-catenin的表达与对照组相比明显升高，4周时多聚集在胞质和细胞核内。当小鼠暴露于AAI8周时，β-catenin多聚集在细胞核内。当Wnt/β-catenin信号通路被激活后，胞质内的破坏复合体不能降解β-catenin，在胞质内过度堆积的β-catenin转移至细胞核内，引发T细胞因子的转录从而激活β-catenin/EMT途径 [17] 。结果表明，在AAN的发展过程中，也出现了Wnt/β-catenin信号通路的激活。我们通过Masson染色以及α-SMA免疫组化染色对小鼠暴露于AAI 4周和8周后的纤维化程度的观察，结果表明，小鼠暴露于AAI后其纤维化程度逐渐加重，最严重时达到对照组的2.7倍以上；α-SMA的免疫组化结果也显示小鼠暴露于AAI 4周和8周后α-SMA的表达显著升高，大量聚集与新生的犬牙状细胞内。因此，我们认为AAN的发展过程中会激活Wnt/β-catenin信号通路，促进肾小管上皮细胞EMT，参与了肾纤维化的过程。而新生的肾小管上皮细胞，这些细胞不仅参与了损伤肾小管的修复，也有少量细胞表达α-SMA蛋白，说明其也可能参与了AAN肾脏纤维化的过程。
综上所述，机体摄入AAI和青木香均可引起AAN的发生，两种药物引起的AAN病理改变相同。在慢性AAN的发展过程中，能够观察到Wnt/β-catenin信号通路的激活，该通路促进肾小管上皮细胞发生EMT转化，促进AAN纤维化的发展，但对于是哪一种Wnt通路的配体所激活的Wnt/β-catenin信号通路以及该信号通路与肾纤维化之间的关系还有待研究。
项目基金
省教育厅特色重点实验室(黔教合KY字[2021] 004)；贵州省基础研究计划(黔科合基础-ZK [2022]一般465)；2020省科技支撑(黔教合支撑[2020] 4Y209)。
参考文献
NOTES
*通讯作者。