1. 引言
桑叶(Folium Mori)，中药名，是桑树的主要产物，为桑科植物桑的干燥叶 [1] 。桑树在我国南北各地种植广泛，主要分布在长江中下游地区 [2] 。我国虽然桑树资源丰富，但桑叶主要用于桑蚕的饲料，其药用价值很少得到深度研究。桑叶富含多糖、黄酮、多酚等多种活性物质 [3] ，陈等人发现桑叶具有调节机体糖脂代谢的功效 [4] ，此外也有学者证实桑叶具有抗氧化和改善肠道微生态平衡等功效 [5] 。石榴皮(Granati Pericarpium)为石榴科植物石榴的干燥果皮。我国石榴有两千多年的种植历史，在南北方均有种植 [1] 。石榴皮可做中药，富含多酚、黄酮、生物碱等化合物 [6] ，具有降血糖、治疗痤疮、抗氧化等多种功效 [7] [8] 。
近年来，抗皮肤糖化这一功效宣称逐渐火热起来，宣称抗糖化功效的化妆品的销售量也在逐年突破新高，因此国内外著名化妆品大牌纷纷在抗糖化上加大了研究力度，尤其热衷于研发具有抗糖化的植物提取物 [9] [10] 。非酶糖基化反应是指蛋白质、脂质或核酸等生物大分子在没有酶参与的条件下，自发地与还原性糖发生的非酶促反应，最终生成大分子的棕色的稳定的共价加成物即晚期糖基化终末产物(AGES) [11] ，AGEs会随着年龄的增加在皮肤中不断聚增，影响皮肤表皮层和真皮层，使真皮层胶原蛋白糖化变黄 [12] 、丧失水分，导致皮肤糖化发黄，最终变成褐色并失去弹性 [13] [14] 。
网络药理学利用节点和连接建立个体间连接的网络，将复杂的生物系统的相互作用抽象表达为网络，通过分析网络的组成关系和特征实现对生物的系统识别 [15] 。本文利用网络药理学探究桑叶–石榴皮复配抗皮肤糖化作用的生物机制，为其在化妆品中宣称抗皮肤糖化提供理论依据。
2. 材料与方法
2.1. 桑叶–石榴皮复配活性成分及靶点收集
利用TCSMP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，以“桑叶”和“石榴皮”为关键词，根据药物代谢动力学特点，设定“口服生物利用度(OB) ≥ 30%”且“类药性(DL) ≥ 0.18”，获得桑叶和石榴皮的活性成分，并收集活性成分所对应的靶点 [9] 。将靶点导入UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)，获得靶点人源基因的Gene Name。通过Cytoscape 3.7.1绘制“植物–活性成分–靶点”网络。
2.2. 皮肤糖化靶点获取
在Genecards (https://www.genecards.org/)和OMIM (https://www.omim.org/)数据库以关键词“type 2 diabetes”和“glycemia”查找与皮肤糖化相关的靶点，将获得的靶点和活性成分的靶点取交集，交集靶点即为桑叶–石榴皮复配抗皮肤糖化的靶点，在网站Venny 2.1.0将植物活性成分靶点与皮肤糖化靶点的关系用Venn图呈现。
2.3. PPI网络构建
将桑叶–石榴皮复配活性成分抗皮肤糖化靶点导入STRING 11.5 (https://cn.string-db.org/)，物种为“Homospecies”，获得PPI关系，保存为TSV格式文件，将其导入Cytoscape 3.7.1绘制网络图。
2.4. GO和KEGG分析
将桑叶–石榴皮复配抗皮肤糖化靶点导入Metascape数据库，进行GO富集和KEGG通路分析，筛选出P < 0.01的通路，根据富集的基因数量选择前20个通路并进行可视化分析。
3. 结果
3.1. 桑叶–石榴皮复配活性成分
桑叶活性成分较多，有茵芋苷、东莨菪碱、槲皮素等30种，石榴皮的活性成分有山柰酚、β-谷甾醇等7种，两者共有的成分为山柰酚、β-谷甾醇、槲皮素，见表1。
3.2. “桑叶&石榴皮–活性成分–靶点”网络图
在TCMSP数据库中收集到桑叶活性成分靶点231个，石榴皮活性成分靶点188个，去除重复靶标，获得桑叶–石榴复配靶点243个。将这243个靶点导入Cytoscape 3.7.1绘制“植物–活性成分–靶点”网络，见图1。图中共包含节点277个，边线851个。左侧紫色图形代表桑叶活性成分，右侧紫色图形代表石榴皮活性成分，上方和下方蓝色图形代表两者共有的活性成分，绿色圆圈代表活性成分靶点，灰色的边线表示植物与活性成和活性成分与靶点间的联系。
3.3. 桑叶–石榴皮复配抗皮肤糖化靶点
对疾病数据库中获得的326个皮肤糖化靶点与231个活性成分靶点取交集，获得共同靶点78个，见图2，即为桑叶–石榴皮复配抗皮肤糖化靶点。
Figure 1. Network diagram of “FM et GP-component-targets”
图1. “植物–活性成分–靶点”网络
Figure 2. Venn diagram of FM-GP Anti-skin glycosylation intersection
图2. 桑叶–石榴皮复配靶点与皮肤糖化靶点韦恩图
3.4. PPI网络
用Cytoscape 3.7.1绘制桑叶–石榴皮复配抗皮肤糖化靶点PPI网络，见图3。节点越大，颜色越深，连接的值越大，以≥2倍中位数的degree值进行筛选，排名前10的靶点分别为AKT1、VEGFA、IL6、TP53、TNF-α、CASP3、IL-1β、MMP9、EGFR。通过靶点对应成分得出，桑叶–石榴皮复配抗皮肤糖化的核心活性成分为槲皮素、山奈酚、花生四烯等。
3.5. 通路富集分析
将获得的78个桑叶–石榴皮复配抗皮肤糖化靶点导入Metascape，进行KEGG通路和GO富集分析。KEGG通路分析得到的重要通路有癌症(Pathways in cancer)、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、胰岛素抵抗(Insulin resistance)、II型糖尿病(Type II diabetes mellitus)等235条通路，见图4。
GO富集分析显示，有4451条结果涉及生物过程，富集基因数量较多的是细胞迁移的正调控(positive regulation of cell migration)、对无机物的反应(response to inorganic substance)、对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)等。有572条结果涉及分子功能，其中细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、激酶调节活性(kinase regulator activity)、蛋白质同二聚化活性(protein homodimerization activity)等富集基因数较多。有342条结果涉及细胞组分，膜筏(membrane raft)、质膜蛋白复合物(plasma membrane protein complex)、转录调节复合物(transcription regulator complex)等排名靠前。GO富集分析气泡图见图4-7。
Figure 4. Enrichment analysis of KEGG
图4. 桑叶–石榴皮复配抗皮肤糖化靶点KEGG富集分析
Figure 5. Enrichment analysis of GO (BP)
图5. 桑叶–石榴皮复配抗皮肤糖化靶点GO (BP)分析
Figure 6. Enrichment analysis of GO (MF)
图6. 桑叶–石榴皮复配抗皮肤糖化靶点GO (MF)分析
Figure 7. Enrichment analysis of GO (CC)
图7. 桑叶–石榴皮复配抗皮肤糖化靶点GO (CC)分析
4. 讨论
近年来皮肤糖化给皮肤外观以及内在带来的问题愈发受到人们的关注，其涉及基因和环境之间复杂的相互作用，往往伴随着多种分子及信号通路的异常改变 [16] [17] 。因此，具有多成分、多靶点、多通路特点的植物复配添加物的化妆品更受到消费者的青睐、也更加具有优势。化妆品领域研究的热点已经成为天然植物提取物 [18] ，桑叶和石榴皮作为传统的中药材，其抗糖化的功效已被研究证实 [19] [20] 。但目前石榴皮和桑叶大都作为废弃物处理，不但没能使这些资源性废弃物得到利用，反而造成了环境污染，提高它们的利用水平将有利于提高农业的可持续性并带来附加价值。
《已使用化妆品原料目录(2021年版)》收录了15种与石榴相关的原料，8种与桑相关的原料 [21] 。与石榴相关的原料在化妆品中的作用为抗脂质过氧化、延缓衰老、收敛毛孔和抑制黑色素细胞活性，石榴皮提取物可用作抗皱剂、抗氧化剂、抗菌剂和美白剂。与桑叶相关的原料能柔润皮肤、抑制酪氨酸酶的活性、防治因雄性激素偏高引发的座疮等。从桑叶和石榴皮在化妆品中发挥的功效中，可以看出它们能解决皮肤糖化产生的色斑、发黄、皱纹等问题，可作为抗皮肤糖化功效物质。
网络药理学的研究显示，桑叶–石榴皮中的活性化合物作用于AKT1、VEGFA、IL6、TP53、TNF-α等靶点，通过癌症通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、胰岛素抵抗等信号通路发挥抗皮肤糖化作用。同时结合市场上添加桑叶和石榴皮的化妆品的作用功效，也证实含有桑叶和石榴皮添加物的化妆品具有抗皮肤糖化的作用功效。上述结果可为桑叶–石榴皮复配在化妆品抗皮肤糖化等功效宣称方面的开发和应用提供理论依据，但还需进行实验研究加以论证。