1. 引言
国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer, IARC)最近期发布的GLOBOCAN 2020中显示肝癌的发病率(9.5/10万)在所有癌症中位列第六，死亡率(8.7/10万)位列第三 [1] 。而中国肝癌的发病率(18.2/10万)在所有癌症中位列第四，死亡率(17.2/10万)位列第二，远高于世界水平。肝癌的发病率随经济水平的增高而增长 [2] [3] 。乙肝病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染是导致原发性肝癌的主要病因之一 [4] ，据估计，我国HBsAg的流行率为5%~6%，约有7000万例的HBV感染者，而慢性乙型肝炎患者(Chronic Hepatitis B, CHB)约有2000万例~3000万例 [5] [6] 。目前临床上尚缺乏精准的模型来预测肝癌的发生 [7] ，因此肝癌的早期筛查对于肝癌的早诊断早治疗尤为重要，甲胎蛋白(Alpha Fetal Protein, AFP)作为目前临床上使用最为广泛的肿瘤标志物，其在肝癌筛查中的灵敏度并不高，往往需要与其他肿瘤标志物联合使用来提高诊断价值。糖组学的发展证实当肝脏发生癌变后，血清中寡糖链的构成和含量会发生变化，据此，可利用血清寡糖链的检测来筛查肝癌的发生。本次研究即是将寡糖链检测应用于临床，探索其在肝癌中的诊断价值。
2. 资料和方法
1) 一般资料：选取自2019年8月至2019年10月于空军军医大学第二附属医院(唐都医院)就诊并进行AFP和G-test检测的患者和健康体检者共410例，根据患者病情状态将其分为乙肝相关性肝癌(Hepatocellular Carcinma, HCC)组、乙肝相关性肝癌治疗后(Post-Treated HCC)组、慢性乙肝肝硬化(Hepatitis B Cirrhosis, HBC)组、慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B, CHB)组、慢性乙型肝炎合并肝血管瘤(CHB Complicating with Hepatic Hemangioma, CHB & HH)组、慢性乙型肝炎合并肝囊肿(CHB Complicating with Hepatic Cyst, CHB & HC)组、其他肿瘤(Other Cancers)组和健康(Health)组共8组。
2) 诊断标准：HCC按照《原发性肝癌诊疗规范(2022年版)》 [8] 进行诊断，Post-Treated HCC指经过外科治疗、局部消融治疗、TACE、放射治疗或全身治疗的HCC。CHB和HBC按照《慢性乙型肝炎防治指南(2022年版)》 [5] 进行诊断，其他疾病按照相应诊疗标准进行诊断，健康对照组为唐都医院体检中心同期体检者。排除标准：年龄 > 90岁；妊娠；合并HIV感染；原发性肝癌合并其他肿瘤；其他病因所致的肝炎、肝硬化或肝癌；临床资料信息不完善。该研究经唐都医院伦理委员会批准通过(第202004-03号)，所有受试对象均知情同意。
3) 实施方法及观察指标：患者均于清晨空腹采取静脉血10 ml，2~8℃静置1 h，3000 r/min离心15 min，分离血清，−20℃保存待测。采用荧光标记毛细血管微电泳分离技术监测患者血清中的G-Test。步骤简述如下：血清蛋白在变性后，使用肽N-糖苷酶F消化分离出N-糖，继而将游离的N-糖进行荧光G3A标记、去唾液化(G-test试剂盒；江苏先思达生物技术有限公司)，随后使用DNA测序仪(ABI3500Dx测序仪)进行分离。通过GeneMapper版本3.7软件测量峰的高度，并将每个峰的高度转换为所有峰总数的百分比，即寡糖组分的相对含量关系(结果用G值表示) [9] [10] [11] 。G值 ≥ 5定义为G-test阳性，<5定义为G-test阴性。抽取2 μL使用电化学发光法在AFP检测试剂盒(德国罗氏诊断产品有限公司)和Roche Cobas 801分析仪(德国罗氏诊断产品有限公司)中进行AFP检测，AFP含量 ≥ 7 ng/ml定义为AFP检测阳性，<7 ng/ml定义为AFP阳性。
4) 统计学方法：使用SPSS 26.0软件进行统计分析，计量资料比较使用t检验，计数资料比较使用卡方检验。使用GraPhPad Prism 7.0进行受试者工作特征(Receiver Operator Characteristic, ROC)曲线分析。连续变量相关分析使用Pearson相关分析，灵敏度、特异度的比较使用配对四格表的McNemar检验，检验水准α取0.05。
3. 结果
3.1. 患者统计临床资料后进行对比
本研究纳入410例受试对象，其中HCC组41例，Post-Treated HCC组49例，HBC组69例，CHB组68例，CHB & HH组6例，CHB & HC组7例，Other Cancers组73例(肠癌18例，胃癌45例，食管癌3例，胆囊癌1例，胆管癌1例，胰腺癌5例)，Health组97例。HCC组平均年龄大于HBC组，HBC组大于CHB组，部分组别间年龄、性别构成存在统计学差异(见表1)。
Table 1. General information of the subjects
表1. 受试对象一般资料
3.2. G-Test、AFP和年龄、性别的相关关系
在上述8组中每组随机抽取6例，共48例，Pearson相关分析结果显示G-test值、AFP含量均与年龄没有相关性(P = 0.718, P = 0.307)，男女之间G-test和AFP含量无统计学差异(P = 0.226, P = 0.276) (见图1)。
Figure 1. Correlation analysis between G-test, AFP, age, and gender. Abbreviation: NS, P ≥ 0.05
图1. G-test、AFP与年龄、性别相关性分析。缩写：NS，P ≥ 0.05
3.3. G-Test和AFP检测结果
HCC组G-test值(6.928 ± 1.584)显著高于Post-Treated HCC组(4.609 ± 2.568, P < 0.0001)、Other Cancers组(3.894 ± 2.371, P < 0.0001)、HBC组(3.544 ± 2.261, P < 0.0001)、CHB组(2.525 ± 1.681, P < 0.0001)、CHB & HH组(5.233 ± 2.144, P = 0.023)和Health组(2.043 ± 0.956, P < 0.0001)。HCC组AFP值(9511.605 ± 19944.718)显著高于Other Cancers组(11.053 ± 59.739 ng/ml, P < 0.0001)、HBC组(16.164 ± 79.276 ng/ml, P = 0.0001)、CHB (55.608 ± 260.287 ng/ml, P = 0.0002)和Health组(3.626 ± 2.061 ng/ml, P < 0.0001)。而HCC组AFP值与Post-Treated HCC组、CHB & HH组和CHB & HC组相比无统计学差异(P = 0.307)。CHB & HH组(5.233 ± 2.144)和CHB & HC组(5.767 ± 2.237) G-test值显著高于CHB组(P = 0.0004和P < 0.0001)，而AFP值却无统计学差异(P = 0.622和P = 0.609) (见表1、图2~图4)。
Figure 2. Comparison of G-test and AFP in HCC group, HBC group, CHB group, Health group, and Other Cancers group. Abbreviation: *****: P < 0.0001; ***: P < 0.001; OC: Other Cancers
图2. HCC组、HBC组、CHB组、Health组、Other Cancers组G-test和AFP比较。缩写：****：P < 0.0001；***：P < 0.001；OC：Other Cancers
Figure 3. Comparison of G-test and AFP between HCC group and Post-Treated HCC group. Abbreviation: ***: P < 0.0001; NS, P ≥ 0.05
图3. HCC组、Post-Treated HCC组G-test和AFP比较。缩写：****：P < 0.0001；NS，P ≥ 0.05
Figure 4. Comparison of G-test and AFP among HCC group, HCC & HC group, and HCC & HH group. Abbreviation: *****: P < 0.0001; ***: P < 0.001; NS, P ≥ 0.05
图4. HCC组、HCC & HC组、HCC & HH组G-test和AFP比较。缩写：****：P < 0.0001；***：P < 0.001；NS，P ≥ 0.05
3.4. G-Test和AFP在HCC中的诊断价值
剔除Post-Treated HCC组、HCC & HC组、HCC & HH组，将HCC组定义为病例组，HBC组、CHB组、Other Cancers组、Health组定义为对照组1，G-test值 ≥ 5定义为阳性，AFP ≥ 7 ng/ml定义为阳性。共收集病例组41例，对照组307例。病例组G-test阳性37例，阴性4例，AFP阳性27例，阴性14例。对照组G-test阳性23例，阴性284例，AFP阳性46例，阴性261例(见表2)。据此，计算G-test诊断肝癌灵敏度为90.2%，特异度为87.6%，总符合率为87.9%，约登指数为0.778，阳性预测值为7.291，阴性预测值为0.111，AFP诊断肝癌灵敏度为65.9%，特异度为89.9%，总符合率为87.0%，约登指数为0.558，阳性预测值为6.522，阴性预测值为0.380 (见表3)，G-test诊断HCC的AUC为0.905，截断值为5.5，对应灵敏度为90.2%，特异度为88.0%，AFP诊断HCC的AUC为0.834，截断值为5.9，对应灵敏度为75.6%，特异度为86.3% (见图5)。
Table 2. Compilation of G-test and AFP diagnostic experimental data
表2. G-test、AFP诊断实验资料整理表
Table 3. Diagnostic value of G-test and AFP in HCC
表3. G-test、AFP在HCC中的诊断价值
分别以Health组、CHB组、HBC组、Other Cancers组为对照组2、对照组3、对照组4、对照组6，CHB组和HBC组合并为对照组5，HCC组为实验组，计算出G-test在健康人群、CHB患者、HBC患者、CHB & HBC患者和Other cancers患者中诊断HCC的特异度分别为99.0%、91.2%、84.1%、87.6%、72.6%。AFP在以上患者中诊断HCC的特异度分别为95.9%、79.4%、88.4%、85.4%、93.2%。在HCC患者和其他肿瘤患者中，AFP的特异度大于G-test，其中在其他肿瘤患者中显著高于G-test (P = 0.003) (见表4)。G-test和AFP在上述5组人群中的诊断HCC的ROC曲线如图6所示，G-test的AUC分别为0.977，0.935，0.853，0.894，0.830，AFP的AUC分别为，0.844，0.792，0.846，0.819，0.850。
Figure 5. ROC curve of HCC diagnosed by G-test and AFP. ROC curve area: the area under the ROC curve; Cut off value: Truncated value; Sensitivity: sensitivity; Specificity: specificity
图5. G-test和AFP诊断HCC的ROC曲线。ROC curve area: ROC曲线下面积；Cut-off value:截断值；Sensitivity：灵敏度；Specificity：特异度
Table 4. The specificity of G-test and AFP in the diagnosis of HCC in different populations
表4. G-test和AFP在不同人群中的诊断HCC的特异度
Figure 6. ROC curves of G-test and AFP diagnosis for HCC in different populations. (a) ROC curve in CHB patients; (b) ROC curve in HCB patients; (c) ROC curves in patients with CHB and HCB; (d) ROC curves in other tumor patients; (e) ROC curve in healthy populations
图6. G-test和AFP诊断在不同人群中诊断HCC的ROC曲线。(a) 在CHB患者中ROC曲线；(b) 在HCB患者中的ROC曲线；(c) 在CHB和HCB患者中的ROC曲线；(d) 在其他肿瘤患者中的ROC曲线；(e) 在健康人群中的ROC曲线
4. 讨论
目前国内外关于G-test的临床研究较少 [12] [13] [14] [15] ，本次试验根据临床诊断将试验对象分为8组，为保证各种病例的均衡性，减小选择偏倚，从8组中各随机抽取6例共48例进行年龄、性别和G-test、AFP相关性的分析，分析得出年龄、性别和G-test、AFP之间不存在相关性(见图1)，由此8组中部分组别之间年龄、性别虽存在统计学差异，但其可暂不予考虑。HCC组的G-test值和AFP含量显著高于其他组(见图2)，但同时发现HCC治疗后组G-test值明显低于HCC组，AFP却不存在这一差异(见图3)，说明G-test在评价HCC治疗效果中可能存在一定价值。乙肝合并血管瘤或肝囊肿的患者G-test值也有所升高，AFP无明显变化，提示G-test在区别良恶性肿瘤的能力可能存在不足，但此差异也可能是因为血管瘤和肝囊肿样本量不足所致。对治疗后HCC、肝血管瘤、肝囊肿进行亚组分析是本实验不同于G-test临床试验的区别之一。剔除治疗后HCC、肝血管瘤、肝囊肿对试验可能存在的影响，计算G-test的灵敏度显著高于AFP (90.2% VS 65.9%, P = 0.031)，而特异度低于AFP，但无统计学差异(87.6% VS 89.9%, P = 0.435)，总符合率、约登指数、阳性预测值、阴性预测值均优于AFP。此结果与其他学者发表的结果基本一致，但特异度的显著提高可能是因为试验剔除了病例组中治疗后的患者。G-test诊断HCC的ROC曲线下面积是0.905，高于AFP。
在临床实践中，在已知患有乙肝、乙肝肝硬化、其他肿瘤或身体健康条件下，可通过G-test提高肿瘤的诊断效能，因此我们对对照组进行了亚组分析，得出G-test健康组、乙肝组、肝硬化组、乙肝和肝硬化组、其他肿瘤组中的特意度分别为99.0%、91.2%、84.1%、87.6%、72.6%，AFP为95.9%、79.4%、88.4%、85.4%、93.2%，除其他肿瘤组外，其他组均无统计学差异。在以上亚组中，G-test的AUC分别为0.977、0.935、0.853、0.894、0.830，除其他肿瘤组外，依旧高于AFP。G-test和AFP诊断HCC的灵敏度和特异度的Kappa值均小于0.4，说明二者一致性差，这提示我们可用并联的联合诊断来提高HCC的灵敏度，串联的联合诊断来提高HCC的特异度。
对肝癌风险人群的识别、宣传和早期筛查，加之可靠、规范的筛查监测手段是提高肝癌早期诊断的必备条件 [16] 。目前针对肝癌的肿瘤标志物有AFP、甲胎蛋白异质体、高尔基体蛋白、热休克蛋白、骨桥蛋白等，然而AFP仍旧是应用最广泛的肿瘤标志物，也是探索其他肿瘤标志诊断价值的比较标准 [17] 。AFP的灵敏度低，尤其是在早期肝癌中的诊断价值，往往需要与其他肿瘤标志物或辅助检查联合诊断，这便与肝癌的早诊断早治疗的目标相悖 [18] 。本次试验证实G-test在乙肝相关性肝癌中具有较好的诊断价值，尤其是其灵敏度远高于AFP，可为肝癌的诊断提供重要的参考价值。从已发表的G-test相关文献来看 [19] [20] ，目前的临床研究均是针对乙型肝炎病毒相关肝癌，然而G-test在其他病因所致肝癌诊断、在肝脏转移癌诊断、肝癌发生预测中的价值，有待我们进一步的研究。
NOTES
*通讯作者。