摘要: 目的：通过生物信息学方法筛选强直性脊柱炎(AS)间充质干细胞核心基因并探讨其作用机制。方法：在GEO数据库中获取AS转录谱数据并使用R语言对其进行差异基因分析，再使用R软件对差异基因进行基因本体(GO)功能、京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析，通过STRING在线数据库和Cytoscape软件来构建蛋白－蛋白相互作用(PPI)网络并筛选枢纽(Hub)基因，最后利用R软件对Hub基因的表达水平进行相关性分析。结果：经R软件DEG分析后得到101个差异基因(DEGs)，其中55个上调基因，46个下调基因。GO分析主要涉及多生物繁殖、多细胞生物过程，PiRNA代谢过程，免疫反应等。KEGG分析主要涉及PI3K-Akt信号通路。筛选出前10位Hub基因为ZIC1、EN1、TBX15、PITX2、PSG3、PSG4、PSG6、CPE、HOXC8、MAP2，它们之间的表达存在正相关。结论：DEGs和Hub基因可能在AS的发生发展中发挥着重要作用，主要与炎症反应，骨骼代谢，软骨细胞增殖分化等相关。
Abstract:
Objective: This paper aims to screen the core genes of mesenchymal stem cells in ankylosing spon-dylitis (AS) by bioinformatics and explore its mechanism. Methods: The AS transcription profile da-ta were obtained from the GEO database and the differential gene analysis was performed using R language. The gene ontology (GO) function and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analysis of the differential genes were performed using R software. The protein-protein interaction (PPI) network was constructed by STRING online database and Cytoscape software, and the hub genes were screened. Finally, the correlation analysis of the expression level of Hub genes was performed using R software. Results: A total of 101 differentially expressed genes (DEGs) were obtained by R software DEG analysis, including 55 up-regulated genes and 46 down-regulated genes. GO analysis mainly involves multi-biological reproduction, multi-cellular biological processes, PiR-NA metabolic processes, immune responses, etc. KEGG analysis mainly involved the PI3K-Akt sig-naling pathway. The top 10 Hub genes were ZIC1, EN1, TBX15, PITX2, PSG3, PSG4, PSG6, CPE, HOXC8 and MAP2, and there was a positive correlation between their expression. Conclusion: DEGs and Hub genes may play an important role in the occurrence and development of AS, mainly related to inflammatory response, bone metabolism, chondrocyte proliferation and differentiation.
1. 引言
强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis, AS)是一种慢性、进行性的炎症性疾病，主要累及脊柱和骶髂关节，其症状包括腰背部疼痛、僵硬和功能障碍，目前发病率越来越高，年轻成年人也开始出现 [1] 。AS的具体病因尚不完全清楚，其中遗传因素被认为是一个重要的影响因素。大约90%的AS患者携带一种遗传标记物称为HLA-B27抗原，一种假说认为HLA-B27抗原可能通过与细胞内的内源性抗原结合，激活免疫系统，导致炎症反应和组织损伤 [2] ，然而仅有少数携带该标记物的人最终发展为AS。免疫系统的异常反应与AS的发病相关，AS患者的免疫系统可引起自身组织发生异常免疫，导致炎症反应和组织损伤。研究发现 [3] ，炎症细胞和炎症介质的产生和释放会导致关节和骨骼的炎症和破坏 [4] ，炎症因子的过度表达可激发炎症细胞的活化和炎症介质的释放，进一步加剧炎症反应和组织损伤 [5] 。目前AS的治疗主要是缓解症状、减轻炎症和保护关节功能，效果不明显。
近年来，间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)在治疗各种疾病方面展现出了巨大的潜力，其自我更新和多向分化的作用受到了广泛的关注，它可以从多种组织中分离和培养得到，如骨髓、脂肪组织和胎盘等 [6] 。本研究使用基因表达综合数据库(gene expression omnibus, GEO)中的AS表达谱芯片数据作为研究基础，运用生物信息学方法，旨在寻找与疾病相关的差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)和核心(Hub)基因，并评估这些核心基因与AS关联性，深入了解AS发病机制，并为AS的预防和治疗提供新的思路和方法。
2. 材料与方法
2.1. 数据选择
在GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中检索“ankylosing spondylitis”，筛选获得基因谱表达数据GSE134290。该基因谱数据来源于GPL570平台，共包含6个转录组样本，分别比较了正常对照组和强直性脊柱炎患者组在第0天，第3天和第7天成骨诱导期间间充质干细胞的转录谱数据。
2.2. DEGs的筛选
使用R软件(版本4.2.1)将矩阵数据中的探针ID标准化，利用limma包进行差异基因分析。设置logFC > 1，P < 0.05为条件筛选DEG，使用ggplot2和pheatmap包将结果可视化。
2.3. DEGs的富集分析
使用R软件中的clusterProfiler包对差异基因进行基因本体(GO)功能、京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析，并将结果绘制为柱状图。
2.4. PPI网络构建及Hub基因筛选
将DEGs导入STRING在线数据库，设置Organism为“Homosapiens”，构建蛋白相互作用网络关系，并通过Cytoscape 3.9.1软件绘制PPI网络图。并使用CytoHubba插件筛选PPI网络的枢纽基因。
2.5. Hub基因间的相关性分析
使用R软件中Pearson相关分析方法对10个枢纽基因的表达水平进行相关性分析，并绘制相关性分析位图。
3. 结果
3.1. DEGs表达分析
经R软件DEGs分析后得到101个差异基因，其中55个上调基因，46个下调基因。DEGs火山图如图1所示，红色表示上调基因，蓝色表示下调基因；热图如图2所示，颜色深浅代表DEG显著性高低。结果表明AS组与正常对照组的DEGs有较好的差异性。
3.2. DEGs富集分析结果
GO富集分析由生物过程(Biological Process, BP)、细胞组成(Cell Component, CC)、分子功能(Molecular Function, MF)三部分组成，R软件分析得到：DEGs主要涉及多生物繁殖过程，多细胞生物过程，PiRNA代谢过程，负性调节肥大细胞参与免疫反应，细胞通过质膜粘附分子粘附，髓系白细胞介导免疫的负调控等(如图3)。KEGG富集分析表明DEGs主要与细胞外基质–受体互作，蛋白质降解和吸收，糖胺聚糖生物合成，其他聚糖降解等有关；主要涉及PI3K-Akt信号通路(如图4)。
3.3. PPI网络及枢纽基因分析
将101个差异基因通过Cytoscape 3.9.1软件构建差异基因靶点蛋白互相作用关系网络(如图5)，网络图中共有35个蛋白节点，30条边。使用CytoHubba插件筛选得到前10个枢纽(Hub)基因，颜色深浅代表MCC值高低，根据MCC值排序依次为：ZIC1、EN1、TBX15、PITX2、PSG3、PSG4、PSG6、CPE、HOXC8、MAP2 (如图6)，其中ZIC1、HOXC8、CPE、MAP2属于上调基因，其余为下调基因。
Figure 3. GO enrichment analysis of DEGs
图3. DEG的GO富集分析
Figure 4. KEGG enrichment analysis of DEGs
图4. DEG的KEGG富集分析
Figure 5. PPI network diagram of DEGs
图5. DEGs的PPI网络图
Figure 6. Hub genes in PPI network
图6. PPI网络中的Hub基因
Figure 7. Bitmap of correlation analysis between 10 Hub genes
图7. 10个Hub基因间的相关性分析位图
3.4. Hub基因的相关性分析
将10个枢纽基因(ZIC1、EN1、TBX15、PITX2、PSG3、PSG4、PSG6、CPE、HOXC8、MAP2)的表达水平进行相关性分析(如图7)，蓝色和红色分别表示正相关和负相关。饼图面积越大，相关系数越高。结果表明，10个枢纽基因表达之间存在正相关。
4. 讨论
强直性脊柱炎属于中医“痹病”范畴，中医学认为其为本虚标实之证，其发病与多种因素有关：体质遗传、情志因素、饮食习惯、过度劳累等。通常由于肝肾气血不足，外感风寒湿邪侵袭，导致气血运行不畅，经络阻滞，引起脊柱和关节的炎症和骨质增生 [7] 。中医治疗方法主要包括药物治疗、针灸、推拿按摩、中药熏蒸等。西医主要使用非甾体抗炎药(NSAIDs)、疏松剂、生物制剂和物理治疗。对于严重的AS患者，可能需要进行手术治疗，如关节置换术或脊柱手术。间充质干细胞(MSCs)是一类多能干细胞，可以分化为多种细胞类型，MSCs在组织工程和再生医学中具有广泛的应用前景。近来已有的研究结果显示MSCs具有潜在的治疗AS的能力 [8] ，可能成为一种新的治疗策略。研究表明 [9] ，MSCs具有抗炎、免疫调节和组织修复的功能，可以通过多种机制发挥治疗作用。MSCs具备分泌多种抗炎因子的能力，包括转化生长因子-β (TGF-β)和干扰素-γ (IFN-γ)等 [10] ，这些抗炎因子的存在能够有效地抑制炎症反应的发生，并减少炎症介质的生成 [11] [12] ，从而减轻AS患者炎症症状。并且MSCs能够调节免疫系统，抑制免疫细胞的活化和增殖，降低免疫反应的强度，还可以调节免疫细胞的分化和功能，促进免疫耐受的建立 [13] 。此外MSCs的分化细胞功能可以促进软骨和骨组织的修复和再生，减轻AS患者骨质增生和关节损伤 [14] 。
本研究基于GEO数据库获得3名AS患者组与3名正常对照组的数据信息，利用生物信息学方法分析AS潜在枢纽基因，通过R软件DEG分析得到101个DEGs，其中上调基因55个，下调基因46个。然后对DEGs进一步进行GO和KEGG富集分析，GO分析显示DEGs主要涉及多生物繁殖过程，多细胞生物过程，PiRNA代谢过程，负性调节肥大细胞参与免疫反应；细胞通过质膜粘附分子，髓系白细胞介导免疫的负调控等。AS是一种慢性炎症性疾病，炎症反应导致免疫细胞的聚集和活化，进而影响多细胞生物过程；PiRNA在生物体中起着重要的基因调控和基因沉默作用，通过免疫反应影响AS进程；肥大细胞是免疫系统中的重要细胞类型，参与调节炎症反应和免疫反应。根据KEGG富集分析结果显示，DEGs与细胞外基质–受体相互作用、蛋白质降解和吸收、糖胺聚糖生物合成以及其他聚糖降解等关联密切。此外，DEGs还主要参与了PI3K-Akt信号通路。PI3K-Akt信号通路在多个细胞功能和生理过程中扮演重要角色，包括细胞存活、增殖、分化以及炎症反应等。在AS中，PI3K-Akt信号通路异常激活与疾病的发生和发展密切相关。研究发现 [15] ，AS患者的免疫细胞中PI3K-Akt信号通路活性增强，导致炎症反应的过度激活。这主要表现为炎症介质的产生增加、炎细胞浸润和炎症因子释放。这些炎症反应导致关节和脊柱的炎症和损伤，并促进关节的骨质增生。另外，PI3K-Akt信号通路也参与了关节软骨的代谢调控和炎症因子的产生。研究表明 [16] ，在AS患者的关节软骨细胞中，PI3K-Akt通路的激活导致关节软骨的退化和损伤。这些变化促进了骨质增生和关节破坏的发生。
为了进一步分析差异基因在AS发病机制中的作用，通过构建PPI网络，筛选Hub基因，并对它们的表达水平进行相关性分析。筛选得到ZIC1、EN1、TBX15、PITX2、PSG3、PSG4、PSG6、CPE、HOXC8、MAP2等Hub基因，其中ZIC1、EN1、TBX15、PITX2、PSG3的MMC值最高；CPE与ZIC1的相关性最高，EN1、TBX15、PITX2和PSG4相关性次之，提示这些Hub基因可能在AS致病过程中发挥主要或协同作用。ZIC1 (Zinc finger protein of the cerebellum 1)是一个编码转录因子，属于ZIC家族，在胚胎发育和成年后的细胞功能调控中发挥重要作用，通过调控基因组的转录，影响细胞生长过程 [17] 。ZIC1在多个组织和器官中表达，包括大脑、小脑、眼睛、心脏和脊柱骨骼等。ZIC1在脊柱的节段化和分节发育中起到关键作用，它调控脊柱的前后轴向模式和分节模式的形成，影响椎骨的数量、大小和形态，ZIC1的突变或缺失与脊柱裂、脊柱侧弯和脊柱畸形等疾病有关，同时ZIC1可以促进MSCs成骨细胞的分化，并参与骨骼发育和骨再生过程 [18] 。ZIC1与AS关系密切，研究表明 [19] ，AS患者的外周血和关节组织中ZIC1的表达水平显著升高，这表明ZIC1的高表达与AS的发生和炎症反应的激活相关，其可能通过调控炎症反应和骨骼代谢来影响疾病。
EN1 (engrailed homeobox 1)是一种转录因子，主要在脊髓和小脑中表达，可以促进MSCs向神经细胞的分化，并参与神经系统的发育和再生 [20] 。研究表明，EN1在脊柱的节段化和分节发育中起到关键作用，它调控椎骨的形成和分化，影响脊柱的数量、大小和形态。EN1的突变或异常表达与脊柱畸形和脊柱相关疾病的发生和发展有关。EN1的过表达可以促进炎症因子的产生和炎症反应的加剧。这些炎症反应导致关节和脊柱的炎症和损伤，并最终导致AS的发展 [21] 。此外，EN1也参与了骨骼发育和骨质代谢的调控，研究发现，EN1可以调控骨细胞的增殖和分化，影响骨骼的形成和骨质的稳态。在AS中，EN1的异常表达可能导致骨质增生和骨质破坏的不平衡，进一步加剧关节的病变 [22] 。TBX15 (T-box 15)，PITX2 (Pituitary homeobox 2)可维持细胞功能和组织稳态。二者共同参与调控基因的转录和表达，影响细胞生长，同时参与免疫调节、脊髓发育等生理过程 [23] 。炎症反应和免疫系统的异常活化是AS的主要特征，TBX15、PITX2可能通过调节相关基因的表达来影响炎症反应、免疫调节和骨骼重塑等途径参与AS的病理过程。此外，它们在MSCs的软骨和脂肪分化中起到关键作用。研究表明 [24] ，TBX15可以促进MSCs向软骨细胞和脂肪细胞的分化，并参与软骨和脂肪组织的发育和修复。
CPE (Carboxypeptidase E)是一种内质网膜蛋白，其在调节炎症因子和神经肽的合成和处理过程中发挥作用 [25] 。目前尚无直接证据表明CPE与ZIC1的相关性，推测ZIC1可能通过调控CPE的转录活性来影响CPE的表达水平，进而影响神经肽的合成加工，调节神经细胞的增殖、分化和迁移等过程，而这些过程可能与AS的发展有关。炎症反应在AS的发生中起到重要的作用，CPE和ZIC1均可调控炎症因子，可共同通过影响炎症反应和骨骼代谢等途径间接参与AS的发生和发展。PITX2和PSG4、EN1和TBX15尚无直接证据表明其关联性，但根据它们的特点，猜测其也可能通过影响免疫调节和炎症反应等途径间接参与AS的发生和发展。此外，ZIC1、EN1和TBX15在MSCs的分化和功能调控中均发挥重要作用 [26] ，这些转录因子可以调控MSCs的分化能力和分化方向，影响它们分化成特定细胞类型的能力。
综上所述，DEGs和Hub基因可能在AS的发生发展中发挥着重要作用，主要与炎症反应，骨骼代谢，软骨细胞增殖分化等相关。但本研究存在一定局限性，仍处于早期生物信息数据分析阶段，它们与疾病的关联性还缺乏直接的研究证据，尚需进一步的基础研究和临床试验来明确其作用机制。
NOTES
*通讯作者。