非洲马瘟病毒检测技术概述

Overview of African Horse Sickness Virus Detection Technology

摘要: 非洲马瘟是由非洲马瘟病毒引起的具有急性或亚急性的虫媒传染病，死亡率高达95%，有明显的季节性和地域性。目前对于患病马匹无有效治疗措施，发生可疑病例时，必须进行检测、扑杀和隔离，才能阻断病毒的传播，因此亟需建立简便、快速、有效的检测方法。通过介绍当前使用的非洲马瘟病毒的检测方法，归纳出各种方法的优缺点，并对非洲马瘟病毒检测技术的发展方向进行阐述。

Abstract: African horse sickness is a kind of f infectious disease caused by African horse sickness virus. It is acute or subacute insect-borne infectious diseases, fatality rate is as high as 95%, and it is obviously seasonal and regional. At present, there is no specific treatment for infected horses. Test, culling and isolation are necessary when disease outbreak. Therefore, there is also a need to establish nucleic acid detection methods which are simple, fast and efficient. This paper introduces several methods of detecting African horse sickness virus which are widely spread, and summarizes the advantages and disadvantages of these methods. It also illustrates the development direction of the detection technology of African horse sickness virus.

1. 引言

非洲马瘟(African Horse Sickness, AHS)是由非洲马瘟病毒(African Horse Sickness Virus, AHSV)感染马科动物引起的一种非接触性传染的疾病。以呼吸系统和循环系统功能变化为特征，主要临床症状表现为发热、皮下水肿和脏器出血 [1] ，被世界动物卫生组织(WOAH)列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病 [2] 。非洲马瘟病毒(African Horse Sickness Virus, AHSV)属于呼肠孤病毒科环状病毒属，病毒无囊膜，直径约75 nm，基因组由10个双链RNA片段组成，分别编码7种结构蛋白(VP1-7) [3] [4] 和4种非结构蛋白(NS1-3、NS3A) [5] 。根据病毒中和试验，AHSV分为9个血清型，血清型之间有交叉反应 [6] ，但与其他的环状病毒无交叉反应。

起初，非洲马瘟因起源于非洲而得名，主要流行于撒哈拉以南的非洲南部地区，在非洲的东部和南部发现AHSV的所有血清型，而非洲西部和北部仅发现部分血清。从当地零星爆发，然后传至地中海沿岸国家 [7] 。历史上曾爆发本病的国家还有西班牙和葡萄牙 [8] ，近期2004年和2019年，赞比亚和博茨瓦纳与喀麦隆分别报道了AHS的爆发。2020年3月，泰国暴发了非洲马瘟 [9] ，同年8月6日，马来西亚暂停“AHS无疫国状态”。目前，我国虽还未发现非洲马瘟疫情，但周边国家的疫情情况为我们敲响了警钟。非洲马瘟为虫媒传染病，主要通过库蠓等吸血昆虫的叮咬在易感动物间传播，我国境内存在超过300种库蠓属昆虫，加之各国马匹贸易不断增长，AHSV传入我国的风险极大。对非洲马瘟实验室检测方法进行阐述和评价，为我国边防口岸的防疫工作提供参考，保障我国畜牧业健康发展。

目前，AHS的检测方法较多，对疑似患病动物可根据临床症状进行初步诊断，尽管其临床症状和病理变化较为典型，但仍可与其他疾病相混淆，需通过实验室诊断技术对其进行确诊。在AHS的多种实验室诊断技术中，病毒分离、病毒中和试验、补体结合试验、ELISA和RT-PCR方法均为WOAH推荐的实验室检测方法。VP7蛋白为AHSV主要的内衣壳蛋白，在各血清型中高度保守，利用这一特性，国内外学者设计相应引物建立了特异性的RT-PCR检测方法，通过蛋白的表达及单克隆或多克隆抗体的制备建立了ELISA检测方法。国际上唯一的检测AHSV抗体的商品化试剂盒也是基于VP7蛋白建立的竞争ELISA方法。针对不同实验室建立的AHSV检测方法，WOAH组织AHS参考实验室开展了多种RT-PCR方法或ELISA方法检测抗原或抗体的对比试验，结果说明实验室自建的方法与商业化试剂盒的结果符合率较高，在2015年国际比对试验中，WOAH明确指出Agüero针对VP7蛋白建立的实时RT-PC方法是最好的检测方法之一，陆生动物诊断试验与疫苗手册中详细列出了试验程序。在AHS诊断中，根据实际情况综合分析确定检测方法。

2. 血清学检测方法

自然感染存活的马在感染后8~12天内产生AHSV特异性抗体，可用一些血清学方法加以验证，如补体结合试验(Complement Fixation Test, CFT)、病毒中和试验(Virus Neutralization Test, VNT)和酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay, ELISA)。

2.1. 补体结合试验

CFT是一种传统的免疫学技术，用免疫溶血机制做指示系统，用于检测样品中的抗原或抗体的试验，在试验过程中，补体效价的测定是试验成败的关键。针对AHSV的检测，CFT可适用于各种用途的检测，但并非是WOAH推荐的检测方法。早在70年代，Mc Collum通过补体结合试验进行了非洲马瘟和马动脉管炎的鉴别诊断。CFT在布鲁氏菌病的检测中应用较广，在支原体、衣原体的检测中也有应，但由于CFT实验步骤多，操作要求严格，影响结果的因素复杂，试验结果观察主要依据肉眼观察判断，存在主观意识强，不敏感等缺点。随着科技的进步，其被敏感性高、操作更为简便的ELISA方法所取代。目前，实验室较少单纯使用CFT来检测病原，也未见对AHSV检测的报道，而主要是采用与其他检测技术相结合的方法来应用，如李曼研究的与微流控芯片技术的结合。

2.2. 病毒中和试验

中和试验是在体外将病毒与血清混合后接种细胞，通过判定病毒是否具有感染性从而检测血清中是否含有中和抗体的方法，在本方法中，病毒的用量非常关键，过多或过少都影响结果的判断。对于AHSV的检测，根据WOAH建议，此方法适用于疫苗接种后动物个体免疫状态的确认，亦可用于血清学分型。1990年，House利用VNT检测血清特异性抗体，同时评价了5种诊断AHSV的方法，说明了CFT和ELISA方法与VNT方法无差异。VNT方法不常用于初诊，因在疫病感染初期，特异性抗体水平低，但在疫病流行地区，特别是多种血清型同时感染的情况下，对疫病的分型监测有重要意义。虽然该方法特异性较强，但对实验室要求较高，首先实验室需有标准的参考毒株和特定型的血清，其次AHSV的操作需要在生物安全三级的实验室进行，试验的操作步骤较繁琐，耗时长。因此，目前国际上较少采用该方法进行快速检测，但与其他方法相比，仍是AHSV分离株血清分型的“金标准”。

2.3. 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(ELISA)的基本原理是将特异性反应系统、间接放大系统和显示系统结合起来，该方法在检测抗体和抗原方面发挥着重要的作用，在建立ELISA方法时，抗体的浓度、孵育时间及环境温度等因素都对结果有较大的影响。ELISA方法具有快速、准确、重复性好等有优点，是WOAH推荐的检测方法和国际贸易规定的试验方法，也是目前应用最为广泛的AHS诊断方法之一。现已证明，基于可溶性AHSV抗原或重组蛋白VP7抗原的间接和竞争阻断ELISA [10] 可用于检测AHSV群特异性抗体，特别适用于大规模样品筛查 [11] 。应用ELISA法检测非洲马瘟病毒，可以在早期检测出带有非洲马瘟病毒的动物。

酶联免疫吸附试验(ELISA)于1971年首次建立，根据其性质分为间接ELISA、夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA等。经过不断改进，特异性和敏感性逐渐提高，因其具有操作简便，快速，适于大批量检测等优点，在细菌或病毒疾病的诊断方面得到了迅速的发展和广泛应用。目前，ELISA也是AHS诊断应用最为广泛的检测方法之一，根据WOAH诊断手册在非洲马瘟章节的建议，ELISA广泛应用于确认动物群体有无感染、监测AHSV流行感染率，还可以应用于动物运输前有无感染、临诊病例确诊和免疫后个体免疫状态确认等方面。研究显示，国内外学者建立了很多基于VP7蛋白的ELISA检测方法

VP7为主要的内衣壳蛋白，在9个血清型的病毒中最为保守，目前，国内外学者利用杆状病毒系统表达VP7蛋白已建立了多种可检测AHSV抗体的ELISA方法。1996年House [12] 等人基于VP7蛋白建立了AHSV的阻断ELISA方法。2003年Chang Hee Kweon [13] 等制备VP7的单克隆抗体，同时建立了间接ELISA和竞争性ELISA方法，通过分析比较，表明竞争ELISA更具特异性。2005年，Sonja Maree [14] 建立的用于检测马血清中VP7 IgG抗体的间接ELISA方法，通过与传统的血清学检测相比，表明建立的间接ELISA在检测感染马的早期免疫反应和马驹的母体免疫水平下降方面更加敏感。2008年，高志强等采用人工拼接的方式拼接了含有绝大多数线性抗原表位的VP7编码基因片段，并以此建立了间接ELISA方法，与INGENASA公司生产的商品化试剂盒的AHSV阻断ELISA方法进行比较，结果两种方法结果完全吻合 [15] 。随后，曹琛福和潘佳亮等人都针对VP7蛋白建立了AHSV的间接ELISA方法 [16] [17] 。2014年，郑小龙等利用大肠杆菌表达了良好抗原性的VP7蛋白多克隆抗体，建立了IgM捕获ELISA检测方法，可用于早期AHSV感染产生的IgM的检测，此方法特异性高，与其他3种马病病毒阳性血清无交叉反应，通过与进口试剂盒比较，符合率为97.7% [18] 。

3. 分子生物检测方法

3.1. PCR技术(聚合酶链式扩增)

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一种将微量DNA特异性放大扩增的分子生物学技术，由诞生至今已经发展到第三代技术。该技术敏感性高、特异性强，操作简便、快速，对扩增的样品要求不高，仅含微量目的DNA即可，样品可以是新鲜或陈旧，对于疫病中病原的活性也无要求，判断PCR方法能否对目的基因进行扩增的关键在于引物的设计，因此对微生物保守基因的分析至关重要。该试验灵敏性高，控制污染也是实验中常遇到的问题。基于琼脂糖凝胶电泳的常规PCR方法广泛应用于感染动物血液及组织中AHSV的检测，通过扩增产物测序，可进一步对病毒进行基因遗传分析。1994年，Marschat [19] 等人基于NS2蛋白S8基因建立了AHSV的RT-PCR检测方法，其检测灵敏度为101~102 copies/µL，在临床样品的检测中发现RT-PCR技术比病毒分离更早检测到病毒。同年Mizukoshi [20] 、Zientara [21] 和Sakamoto [22] 分别针对NS1基因、VP7第7片段和VP3建立了检测AHSV的RT-PCR方法。随后，Zientara [23] [24] 基于基因组片段7和10建立了检测AHSV的RT-PCR方法，与竞争性ELISA结果进行了比较，用该方法检测证实了AHSV1987年7月首次出现在西班牙中部，可在非洲马病(AHS)动物流行开始的潜伏期检测AHSV核酸，也可用于临床症状不明显的物种的流行病学调查。2004年，Koekemoer [25] 建立了AHSV 9种血清型基因组片段2的RT-PCR方法。2009年，Imadeldin [26] 建立了AHSV的巢式RT-PCR方法，并将PCR检测的灵敏度提高了至少1000倍。2011年，Narender S [27] 等人针对VP2蛋白的保守区域设计引物建立了RT-PCR，与中和试验相比，非常显著地提高了检测的速度和可靠性，随后，Schalkwyk [28] 等人也针对VP2蛋白建立了RT-PCR方法以区分疫苗和野毒感染。2012年和2015年，Guthrie [29] 和Camilla [30] 等人建立了多重RT-PCR方法，并与病毒分离进行了对比，检测一致率为100%。2015年，WOAH曾组织AHS参考实验室进行了试验比对，评估了10种不同的常规RT-PCR方法，证实试验结果一致，其中特别指出2008年Agüero和2013年Ggthrie建立的方法敏感性最高。

3.2. Real-time PCR技术(实时荧光定量PCR)

实时荧光定量PCR比常规PCR方法敏感性更好，检测所需时间更短，在检测动物是否感染AHSV最常用。2008年，Montserrat [31] 和Koekemoer [32] 基于VP7蛋白分别建立了可检测AHSV 9种血清型的实时荧光RT-PCR检测方法和双重荧光RT-PCR方法。2010年，Quan [33] 等人针对VP7蛋白和NS2建立了双重荧光RT-PCR方法，检测灵敏度132拷贝/反应，并且该方法比BHK-21细胞上的病毒分离的灵敏度至少高10倍。随后，Monaco [34] 等人针对VP2蛋白建立了荧光RT-PCR方法，检测灵敏度达0.71 copies/µL。2014年，Katarzyna [35] 等人针对VP1蛋白的Seg-1和Seg-3建立了实时RT-PCR检测方法，可检测AHSV的9中血清型，与VP2蛋白的Seg-2特异性检测结果一致。国内，2013年，赵文华 [36] 基于AHSV基因组S7片段设计一对特异性引物，建立了AHSV染料法(SYBR Green I)实时荧光定量RT-PCR快速检测方法，可对9个血清型的灭火疫苗毒RNA进行很好的检测，另外，赵文华 [37] 又设计2套位于AHSV基因组S7片段的特异性引物及探针，合起来能够检测9个血清型的AHSV。荧光PCR具有引物和探针的双重特异性，因此实时荧光定量PCR比常规PCR具有更强的特异性，此方法通过荧光值直接反应检测结果，操作更简便，省去琼脂糖凝胶电泳步骤，更不易污染。

3.3. 重组酶聚合酶扩增(RPA)

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)是一种新兴的技术，采用PCR原理，在常温条件下快速扩增目标DNA序列。该技术由英国TwistDxInc公司于2006年研发，虽然起步较晚，但发展迅速，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术，该技术关键在于扩增引物和探针的设计，其引物比PCR引物长，设计技术不像传统PCR那样成熟。RPA技术的优势在于DNA的扩增可在37~42℃，20 min内完成，与PCR相比，时间大大缩短。此外该方法不需要昂贵的设备，结果读取多元化可电泳法、荧光探针法和测流层析试纸条法等，特别适合用于基层的现场诊断。2022年，史卫军等 [38] 依据AHSV的S7基因保守区建立了RPA检测方法，该方法的最低检测为2.36 × 10¹ copies/µL，用时仅20 min，对60份临床样品进行了检测，符合了100%。梅明珠 [39] 等针对不同血清型间VP7中的保守序列设计引物和探针，建立非洲马瘟病毒核酸的RT-RAA检测方法，对非洲马瘟病毒阳性质粒的检测灵敏度达到10² copies/µL，检测结果与WOAH推荐的荧光RT-PCR检测结果一致。RPA有诸多优点，可作为PCR方法的补充，随着RPA技术在各领域的持续快速，未来应用会更成熟。

3.4. LAMP检测技术

环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification Method, LAMP)也是2000年后一种新兴的核酸扩增方法，同RPA方法类似，LAMP方法对仪器要求低，扩增过程不需要温度的变化，可在60~65℃温度下进行，检测时间约40 min。两者的不同在于LAMP方法需要2对引物或者3对引物，其结果检测仅需目或视比浊检测。这种简单、方便、快速、的方法最初由日本学者Notomi [40] 提出，现已在检验检疫、疫病防控和食品安全等多个领域应用，虽然LAMP技术非常简单，但其引物设计较为复杂苛刻，正确的引物设计与高质量关键酶的选择是成功进行LAMP扩增的必要条件。2016年，英国Fowler等首次建立AHSV RT-LAMP检测方法，与rRT-PCR相比其检测敏感性为96.1% [41] 。2017年姜睿姣建立了AHSV可视化RT-LAMP检测方法，灵敏度测试表明传统RT-PCR的检测极限为1 × 10⁴ copies/µL，而用RT-LAMP检测方法检测量为1 × 10¹ copies/µL，RT-LAMP的灵敏度为传统RT-PCR的1000倍，与马属动物易感的4种疫病进行特异测试，未见交叉反应 [42] 。2020年李富祥等人建立了AHSV的可视化RT-LAMP现场检测方法，该方法最低可检测到3.2 × 10⁻⁹ ng/μL的RNA，敏感性是普通RT-PCR方法的1000倍，用建立RT-LAMP方法和普通RT-PCR方法对35份马血和5份驴血样同时进行了临床样品的测试，结果表明符合率为100% [43] 。

LAMP产物最开始的检测方式是肉眼观察和电泳检测结果，随着荧光PCR的出现，LAMP扩增荧光检测系统随后被开发出来，同PCR扩增一样需要95℃，5 min的预变性过程，发展到通过添加两条环引物来提高扩增效率。LAMP其独特的恒温扩增模式，快速反应且通常比PCR反应较高的灵敏性，使得其在核酸检测上具有极大的优势。此外还有LAMP与微流体技术的联用 [44] ，LAMP与微芯片的技术联用 [45] 以及LAMP与最近新兴的基因编辑技术联用 [46] 。与各种技术的联用更是增加了检测的方式和扩大了检测的多样性。因此LAMP检测方法会有更加广阔的应用前景。

4. 结论

自上世纪五十年代中非发现AHS以来，国内外学者对AHSV进行了研究，建立了许多检测方法。虽然针对AHSV无统一的国际诊断试剂和检测标准，但通过WOAH组织的AHS参考实验室比对结果，证明了实验室建立的不同方法检测符合率较高。此外，陆生动物诊断试验与疫苗手册对AHS实验室诊断方法及用途做了详细的介绍，根据目的不同选择相应的AHSV检测方法，国内有GB/T 21675-2008和SN/T 2856-2011发布的病原分离鉴定、ELISA、RT-PCR和血清中和试验方法的具体检测方法步骤可供参考。

5. 展望

AHS是马类疾病中致死率最高的一种疾病，虽然地域性较强，但近年来全球一体化进程加剧，疫病流行范围急剧扩大。虽然目前我国马病的整体防控较好，但周边邻国紧张的疫情形势对我国严防境外AHS传入工作提出更高的要求。目前，虽然有商品化的单价或多价弱毒非洲马瘟疫苗可用于预防，但有效的防控仍是防止疫病进入的最有效措施，因此对进境马匹及其制品的AHSV检测是关键。

实验室诊断对于AHSV的确诊有至关重要的意义，目前AHSV实验室检测方法主要有病毒分离鉴定，病毒核酸的PCR检测，病毒抗原或抗体的ELISA检测等方法。对于进境的动物及其制品可用RT-PCR方法或ELISA方法进行快速初步检测，后期确诊可选用动物的血液或脾、肺和淋巴结等组织进行病毒分离。AHS疫情爆发时，可采用RT-PCR方法或病毒中和试验进行分型检测，依据分型结果选取疫苗接种健康动物。对于动物接种疫苗后免疫状态的确认，一般选用ELISA方法和病毒中和试验。对于养殖场等试验条件差的适合现场检测的方法，可选用操作方便、反应时间短的RPA方法和LAMP方法。总之，可根据具体情况选择不同的检测方法进行AHSV的检测。根据目前非洲马瘟流行情况，现场检测要求通量大和快速简便，有时需要对结果定量分析，因此检测方法应向兼顾定性定量、高通量方向发展。为提高诊断结果的可靠性，最好采用一种以上的试验方法来对样品进行检测，特别是对于首发病例更应如此。

基金项目

海关总署科研项目(2021HK175)。

NOTES

^*通讯作者。