宏基因组二代测序技术和Gene Xpert MTB/RIF对肺结核的诊断价值

Diagnostic Value of Metagenomic Next-Generation Sequencing and Gene Xpert MTB/RIF in Pulmonary Tuberculosis

摘要: 目的：对比抗酸涂片、结核分枝杆菌培养、结核分枝杆菌及利福平耐药基因检测(Gene Xpert MTB/RIF)和宏基因组二代测序技术(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)对肺结核诊断的临床价值。方法：回顾分析2021年3月至2023年4月在山东省公共卫生临床中心就诊的175名疑似肺结核患者的临床资料，所有纳入病例均进行痰抗酸涂片、肺泡灌洗液抗酸涂片、痰培养、肺泡灌洗液培养、肺泡灌洗液Gene Xpert MTB/RIF和mNGS检查。比较抗酸涂片、结核杆菌培养、Gene Xpert MTB/RIF和mNGS诊断肺结核的阳性率。结果：175名疑似结核患者共确诊结核126例，灌洗液Gene Xpert MTB/RI敏感度为77.8%，灌洗液mNGS检查阳性率为85.7%高于痰培养法(46.0%)、灌洗液培养法(57.1%)，对于涂片阴性的结核患者Gene Xpert MTB/RIF和mNGS检查阳性率高于培养法(P < 0.05)。结论：mNGS及Gene Xpert MTB/RIF在诊断肺结核方面具有重要意义，极大提高了涂片阴性检出率。

Abstract: Objective: To compare the diagnostic efficacy of acid-fast smear of Mycobacterium tuberculosis, Gene Xpert MTB/RIF and metagenomic next-generation sequencing (mNGS) in pulmonary tuberculosis. Methods: The clinical data of 175 patients with suspected pulmonary tuberculosis attending the Public Health Clinical Center of Shandong Province from March 2021 to April 2023 were retrospec-tively analyzed, and all the included cases underwent sputum antacid smear, alveolar lavage fluid antacid smear, sputum culture, alveolar lavage fluid culture, alveolar lavage fluid Gene Xpert MTB/RIF, and mNGS. Positive rates of antacid smear, Mycobacterium tuberculosis culture, Gene Xpert MTB/RIF and mNGS for the diagnosis of tuberculosis were compared. Results: A total of 126 cases of TB were diagnosed in 175 patients with suspected TB. The sensitivity of Gene Xpert MTB/RIF in lavage fluid was 77.8%, and the positivity rate of mNGS in lavage fluid was 85.7%, which was higher than that of sputum culture method (46.0%) and lavage culture method (57.1%), and the positivity rate of Gene Xpert MTB/RIF and mNGS was higher than that of culture method (P < 0.05) in smear-negative patients with TB. For smear-negative TB patients, Gene Xpert MTB/RIF and mNGS were more positive than culture method (P < 0.05) Conclusion: mNGS and Gene Xpert MTB/RIF are important in the diagnosis of TB, and greatly increase the detection rate of smear-negative TB.

1. 引言

结核病是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的人类疾病，主要累及肺部，使得肺结核成为最常见的临床表现 [1] 。结核病在全球范围内存在，其中发展中国家在结核病负担中所占比例较高 [2] 。在COVID-19大流行期间，未确诊和未治疗的结核病患者有所增加，结核病死亡人数较2019年增加，耐药结核病的负担也增加了3% [3] 。因此，如何快速准确地鉴定结核分枝杆菌是确诊结核病、开展后续治疗及防控的关键一步 [4] 。目前临床上常用的检测MTB的方法有结核分枝杆菌培养、抗酸染色涂片及RT-PCR等检查，传统的检测方法存在病原体检出率低和过程繁琐等问题 [5] [6] 。而近年兴起的宏基因二代测序(metagenomic Next-Generation Sequencing, mNGS)和结核分枝杆菌及利福平耐药基因检测(Gene Xpert MTB/RIF)能够更加全面和高效地检测样本，开始广泛应用于肺结核的鉴别诊断 [7] [8] 。本研究通过对山东省公共卫生临床中心就诊患者的资料进行回顾性分析，探讨肺泡灌洗液mNGS和Gene Xpert MTB/RIF检测在肺结核中的诊断价值。

2. 资料与方法

2.1. 研究对象

选择2021年3月~2023年4月期间在山东省公共卫生临床中心收治的175名疑似肺结核患者进行回顾性研究，其中男性109名，女性66名；45岁以下的患者人数占25.0% (76/175)，45~70岁人数占60.7% (63/175)，超过70岁的患者人数占14.3% (36/175)。所有纳入病例同时进行了痰抗酸涂片、痰结核杆菌培养、肺泡灌洗液抗酸涂片、肺泡灌洗液结核杆菌培养，肺泡灌洗液Gene Xpert MTB/RIF和mNGS检测。其中符合《WS 288-2017肺结核诊断》 [9] 标准，确诊肺结核126例，非结核患者49例。本研究已经通过我院伦理委员会审批(审批号：ZR2020MH005)。

2.2. 研究方法

2.2.1. 抗酸染色涂片

按照《中国结核病防治规划实施工作指南(2008年版)》 [10] 进行操作。

2.2.2. 结核分枝杆菌培养

采用MGIT960系统液体培养法进行结核分枝杆菌培养。首先将收集的样品进行离心、稀释等预处理后，使用专用的接种针或吸管将样本转移到带有MGIT试剂的培养瓶中。样本与试剂充分混合后装入MGIT 960仪器，设置温度和时间参数后仪器将自动监测瓶内气压变化，并记录菌落的生长情况。当培养瓶内菌落增殖到一定程度时，仪器会发出信号提示。根据信号和菌落观察，对菌株进行初步鉴定。

2.2.3. 肺泡灌洗液Gene Xpert MTB/RIF检测

根据Xpert MTB/RIF相关试剂盒操作说明书进行如下操作：首先收集研究对象1份肺泡灌洗液样本后，将标本与样本处理液以1:2的比例混合，涡旋振荡15~30 s，室温孵育15分钟，孵育完成后取2 mL的混合液加入试剂盒，转移至Xpert仪器开启检测程序，结束后可见分析报告。

2.2.4. 肺泡灌洗液mNGS检测

取待测者肺泡灌洗液进行mNGS检测，主要步骤包括使用无菌技术采集肺泡灌洗液样本，确保采集过程无污染。样本进行预处理，包括离心沉淀，去除细胞残渣和固体颗粒等。DNA提取及文库构建，将制备好的文库进行高通量测序，最后进行数据分析及报告。

2.3. 观察指标

统计痰抗酸染色涂片、肺泡灌洗液抗酸涂片、痰培养、肺泡灌洗液培养、肺泡灌洗液Gene Xpert MTB/RIF和mNGS的检测情况。以培养法为标准，对比肺泡灌洗液Gene Xpert MTB/RIF和mNGS阳性率。以临床诊断为标准，观察以上检测方法的阳性率。对于涂阳或涂阳患者以上检测方法的敏感度。

2.4. 统计方法

数据库的建立采用EXCEL表格，采用SPSS 26.0统计软件，计数资料采用率来描述，多组计数资料间的比较采用χ²检验进行相关统计分析，P < 0.05认为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. 不同检测方法的检测情况

在175例疑似肺结核患者中，痰涂片检测阳性为40例(22.9%)，阴性135例(77.1%)，肺泡灌洗液涂片阳性为47例(26.9%)阴性128例(73.1%)，痰培养阳性的59例(33.7%)，阴性116例(66.3%)，肺泡灌洗液培养阳性为74例(42.3%)，阴性101例(57.7%)肺泡灌洗液Gene Xpert MTB/RIF阳性的为98例(56%)，阴性77例(44%)，肺泡灌洗液mNGS阳性为108例(61.7%)，阴性67例(38.3%)。59例痰培养阳性的患者中有57例为MTB感染，1例为非结核杆菌感染；74例灌洗液培养阳性的患者中72例为MTB感染，2例为非结核杆菌感染，见表1。抗酸涂片、液体培养、Gene Xpert MTB/RIF、mNGS四种方法检测时间约为15 min、3~5天、2~3 h、24~72 h。肺泡灌洗液mNGS阳性的患者中可伴有肺炎克雷伯菌、表面葡萄球菌等其他细菌、真菌等病原微生物检出。

Table 1. Detection situation of different testing methods [cases (composition percentage (%)]

表1. 不同检测方法的检测情况[例(构成比%)]

3.2. 以培养法作为金标准比较Xpert MTB/RIF和mNGS的检测效能

在175例疑似肺结核患者中，以痰培养作为金标准比较时，在痰培养阳性的58例患者中(不包括鉴定为非结核杆菌感染的1名患者)，Xpert MTB/RIF阳性47例，mNGS阳性52例敏感度分别为81%、89.7%，见表2。以肺泡灌洗液培养作为金标准比较时，在肺泡灌洗液培养阳性的72例患者(不包括鉴定为非结核杆菌感染的2名患者)中Xpert MTB/RIF阳性57例，mNGS阳性63例，敏感度分别为79.2%、87.5%，见表3。两者相比无明显统计学差异。

Table 2. Comparison of the detection efficacy of Xpert MTB/RIF and mNGS using sputum culture assay as gold standard

表2. 以痰培养法作为金标准比较Xpert MTB/RIF和mNGS的检测效能

Table 3. Comparison of the detection efficacy of Xpert MTB/RIF and mNGS using alveolar lavage fluid culture assay as gold standard

表3. 以肺泡灌洗液培养法作为金标准比较Xpert MTB/RIF和mNGS的检测效能

3.3. 不同方法检测效能比较

在175例疑似结核患者中临床确诊126例，其中痰培养敏感度46% (58/126)，灌洗液培养敏感度57.1% (72/126)，灌洗液Xpert MTB/RIF敏感度77.8% (98/126)，灌洗液mNGS敏感度85.7% (108/126)，灌洗液Xpert MTB/RIF阳性率高于痰培养、灌洗液培养检测，且差异有统计学意义；mNGS阳性率高于痰培养、灌洗液培养检测，差异有统计学意义，与灌洗液Xpert MTB/RIF阳性率无明显统计学差异。

3.4. 涂片法与各种检测对比

在126名确诊结核患者中，在痰涂片阳性患者39例，其中痰培养阳性20例，灌洗液培养阳性24例，灌洗液Xpert MTB/RIF阳性36例，灌洗液mNGS阳性37例，在痰涂阳患者中以上四种方法的敏感度分别为51.3%、61.5%、92.3%、94.9%；在86例痰涂阴的结核患者中，痰培养阳性38例，灌洗液培养阳性48例，灌洗液Xpert MTB/RIF阳性62例，灌洗液mNGS阳性71例，在痰涂片阴性的肺结核患者中上述四种检测敏感度分别为44.2%、55.8%、72.1%、82.6%。在126确诊肺结核患者中灌洗液涂片阳性患者47例，其中痰培养阳性23例，灌洗液培养阳性30例，灌洗液Xpert MTB/RIF阳性41例，灌洗液mNGS阳性42例，灌洗液涂阳患者中上述四种方法敏感度分别为48.9%、63.8%、87.2%、89.4%；在79例灌洗液涂阴的结核患者中，痰培养阳性35例，灌洗液培养阳性42例，灌洗液Xpert MTB/RIF阳性57例，灌洗液mNGS阳性66例，灌洗液涂阴患者中上述四种方法分别为44.3%、53.2%、72.2%、83.5%。在涂片阴性患者中灌洗液XpertMTB/RIF阳性率高于痰培养、灌洗液培养检测，且差异有统计学意义；mNGS阳性率高于痰培养、灌洗液培养检测，差异有统计学意义，与灌洗液Xpert MTB/RIF阳性率无明显统计学差异。见表4。

Table 4. Comparison of smear method with various tests (cases)

表4. 涂片法与各种检测对比(例)

4. 讨论

结核病作为目前全世界最为常见的传染病之一，其传染性较强，在疾病传播方面仅次于新型冠状病毒感染(coronavirus disease 2019, COVID-19) [11] [12] 。新冠病毒大流行证明了快速且有效的诊断性检测对预防严重疫情的传播起重要重要 [13] [14] 。目前病原学诊断包括抗酸染色、MTB培养及核酸检测。涂片镜检因其操作简单，能快速直观的观察镜下结构，成为临床常用的病原学检测方法，但其存在阳性率低，不能鉴别结核分枝杆菌或非结核分枝杆菌等问题 [15] [16] 。培养法因其敏感度高，特异性强的特点，成为诊断结核病的“金标准”方法之一，但其培养周期长，需要三周以上才能得到结果，无法满足临床快速诊断的需求，临床应用大大受限 [17] [18] 。近年来，随着分子生物学技术的不断革新，聚合酶链反应PCR技术因其高效、敏感且特异的特点，已经成为医学领域的热门技术之一，在诊断肺结核方面具有独特的优势 [19] [20] 。Gene Xpert MTB/RIF检测是基于实时荧光定量PCR (RT-PCR)对结核分枝杆菌特异性的rpoB基因的利福平耐药核心区间进行检测，通过半定量分析，在短时间内检测出其是否存在突变，同时因其封闭式自动化的检测系统，在一定程度上减少了人为因素造成误差其检测快速、灵敏度高 [21] [22] 。高春景 [23] 等人研究对比了Xpert MTB/RIF及培养药敏两种方法，发现Xpert MTB/RIF对MTB的检出率高，可以快速检测利福平耐药结核。尽管Xpert MTB/RIF试验被认为是结核病的优秀分子诊断测试，但它也有一些缺点，一是它依赖于识别利福平(RIF)的耐药性来指示或分类样本是否具有多药耐药结核病(MDR-TB) [24] [25] 。二是Gene Xpert系统只能检测结核分枝杆菌，对于非结核分枝杆菌无法进行检测，因此对于存在混合感染的肺结核患者，无法进行全面的病原学检测 [26] 。

宏基因组学二代测序mNGS是一种利用高通量测序技术对各种复杂样品中所有微生物DNA进行全基因组测序的方法，通过分析序列数据，可以得出每个微生物群落的结构和功能信息 [27] [28] 。mNGS在准确检测出MTB的同时可以识别多种病原体，包括各种细菌、真菌、病毒等，相较于其他传统的检测方法，mNGS技术提高了肺结核诊断效率和准确性 [29] [30] [31] 。史翠琳 [7] 等人最近的一项研究表明，mNGS对MTB的检测灵敏度为47.92%，明显高于其他三种检测方法，其中Gene Xpert (45.83%)、培养(46.81%)、抗酸杆菌染色(29.17%)。同时mNGS对于肺外结核诊断具有较高的应用前景。孙雯雯 [32] 等人研究发现mNGS对于肺外结核诊断的敏感度明显高于涂片法、Gene Xpert法及培养法。因此mNGS对于不同类型的结核病都显示出一定的优势，提高早期诊断率，缩短诊断周期 [33] 。

本研究显示Gene Xpert (77.8%)和mNGS (85.7%)检测MTB阳性率明显高于培养法，对于涂片阴性的结核患者，肺泡灌洗液Gene Xpert和mNGS检测在MTB阳性率液明显高于培养法，可极大程度上减低漏诊病例。以上结果说明了Gene Xpert及mNGS应用在检测结核分枝杆菌，快速且有效地诊断结核病方面有重要意义，可为临床用药提供更为精准的参考。

5. 结论

mNGS检测及Gene Xpert相对于抗酸染色法和培养法在诊断结核病方面有显著的优势，对于涂片阴性的结核病患者来说，应用mNGS及Gene Xpert是一种准确且高效的检测手段，极大地减少了漏诊，在临床上具有较高的应用价值。

致谢

感谢山东省公共卫生临床中心给予的数据支持以及山东省自然科学基金重大基础研究项目(项目号：ZR2021ZD35)给予的资助。

基金项目

山东省自然科学基金重大基础研究项目(项目号：ZR2021ZD35)。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。