基于叶绿体全基因组核苷酸变异位点的大豆属(Glycine Willd.)植物的分子鉴定新方法

A Novel Method for Molecular Identification at Species Level in Glycine Willd. Using Variable Nucleotide Characters from Complete Chloroplast Genomes

摘要: 高通量测序技术大幅降低了获得基因组序列的成本，为大豆属植物资源多样性的精准鉴定提供了新的数据来源。我们利用来自大豆属7个近缘种的叶绿体全基因组的2363个核苷酸变异位点作为分子性状编制分子鉴定检索表，成功鉴定7个近缘种。这些特有变异位点的数量及核苷酸构成存在种间差异。大豆(Glycine max (L.) Merr.)、白毛烟豆(G. stenophita B.E.Pfeil & Tindale)、镰荚烟豆(G. falcata Benth.)、绢毛烟豆(G. canescens F. J. Herm.)以及扁豆荚大豆(G. dolichocarpa Tateishi & H. Ohashi)的特有变异位点中，A或T的比例(26.74%~42.62%)均高于C或G(9.84%~21.31%)；短绒野大豆(G. tomentella Hayata)中，A、T或C的比例(26.36%~27.91%)均高于G的比例(19.38%)；玫红野大豆(G. syndetika B. E. Pfeil & Craven)中，T或G的比例(30.00%)均高于A或C的比例(18.33%~21.67%)。结果显示叶绿体基因组的单核苷酸变异位点信息，可用于大豆属植物的分子鉴定。本研究对于大豆属植物种质资源的分类鉴定、保护和利用具有重要价值。

Abstract: High-throughput sequencing technology has greatly decreased the experimental cost for yielding genome sequences and provided a new source of data for accurate identification of plant resource diversity in genus Glycine. 2363 species-specific variable nucleotide characters in the complete chloroplast genome of 7 Glycine species were used as molecular traits to identify Glycine plants and compile a molecular classification key for the first time. There are differences in aspects of amount and base composition of variable nucleotide characters between the species. The proportion of A or T (26.74%~42.62%) is higher than that of C or G (9.84%~21.31%) in Glycine max (L.) Merr., G. stenophita B.E.Pfeil & Tindale, G. falcata Benth., G. canescens F.J.Herm. and G. dolichocarpa Tateishi & H. Ohashi. The proportion of A or T or C (26.36%~27.91%) is higher with that of G (19.38%) in G .tomentella Hayata. The proportion of T or G (30.00%) is higher than that of A or C (18.33%~21.67%) in G. syndetika B. E. Pfeil & Craven. Our results indicated that species-specific variable nucleotide characters from the chloroplast genomes could be used for discrimination of different genotypes in Glycine. This study is valuable for identification, conservation and utilization of plant germplasm resources of Glycine.

1. 引言

大豆(Glycine max)是粮、油和饲料蛋白兼用的重要经济作物之一，常用来加工各种豆制品、榨取豆油、酿造酱油和提取蛋白质，大豆食品提供了人类必需的营养。大豆食品产业是食品经济中的大健康支柱产业。联合国粮食与农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO)的数据显示，大豆产量超过其它所有油料作物之和 ‎[1] ‎[2] ‎[3] ‎[4] 。

2023年底的数据显示，全球大豆产量为3.9888亿吨。巴西的大豆产量(~1.61亿吨/年)世界第一。中国的大豆总产量(~2,084万吨/年)世界第四。中国的大豆消费总量(~1.17亿吨/年)世界第一，占全球大豆消费市场的约30%。在中国，80%以上的大豆用于豆油压榨和饲料加工，近20%的大豆用于食品加工和农用种子等其他消费。大豆油占中国植物油消费总量的约50% ‎[3] ‎[4] ‎[5] 。豆粕(大豆提取豆油后的副产品)、豆渣(生产豆奶或豆腐过程中的副产品)或大豆磨成的粗粉常用作畜禽饲料。中国是一个畜牧业大国，大豆是畜禽养殖用蛋白粕的主要原料，这也是中国大豆消费量居世界第一的主要原因。中国每年的大豆进口量约1亿吨。中国97%以上的进口大豆来自大豆产量全球排名前三的巴西、美国和阿根廷，从加拿大、乌拉圭、俄罗斯等国有少量进口 ‎[3] ‎[4] 。中国的大豆产量和需求量差距巨大，对进口的依赖度高，大豆进口量在全球贸易中的所占比例较高，实现大豆完全自给需要做大量工作。

中国是大豆食品加工和消费大国，已有4000多年的大豆种植和食用历史。每年85%以上的国产大豆用于食品加工。大豆食品种类多，例如，豆腐、豆花(豆腐脑)、腐竹、豆腐干、豆酱、豆腐乳、豆浆、豆奶、大豆蛋白配料、大豆肽等 ‎[3] ‎[4] ‎[6] ‎[7] 。利用大豆、豌豆、面筋等植物蛋白作为原料开发的仿肉制品，市场销售额有持续增长的趋势 ‎[8] 。

大豆食品加工业对原料大豆品质的要求精细化程度较高。例如，亚麻酸、油酸和亚油酸含量较低的大豆品种适用于加工豆浆和豆奶类，是由于大豆籽粒中可溶性固形物、亚麻酸、油酸和亚油酸影响豆浆的整体风味。豆芽生产需要选用小粒、发芽率高、脂肪含量低的大豆品种。中小粒径、种皮黑色或褐色、蛋白质含量低、糖分含量高的大豆品种适用于生产豆豉。酱油酿造则选用蛋白质含量和糖分含量高的大豆品种。吸水能力强、粒形整齐一致、小粒径的大豆适于加工纳豆 ‎[3] ‎[4] ‎[6] 。

大豆的营养化学品质具有产地差异。营养化学品质包括蛋白质、脂肪、碳水化合物、无机盐等物质的含量。根据大豆育种、生产以及消费等多方面的需求和技术指标，培育出了一些品质特色较为明显的新品种。植酸(phytic acid，植物种子中的一种有机磷类化合物)可以与蛋白质螯合，减缓蛋白质凝固速率，影响豆腐的得率和质地 ‎[3] ‎[9] ，由此培育出了适宜加工豆腐的‘齐黄34’和‘中黄13’等品种。此外，还培育出了适宜加工豆浆的品种‘东农252’和‘东农253’，适宜加工豆腐干的大豆品种‘东农42’、‘吉育204’以及‘东农48’，适宜加工豆腐乳的品种‘辽豆66’等 ‎[3] ‎[4] 。蛋白产品中存在豆腥味时，难以进入国际高端产品市场，附加值不高。为了适应需求，也培育出了无腥味的大豆品种 ‎[3] ‎[4] 。然而，在生产和原料供给方面，混种、混收、混用仍然是大豆食品加工领域的难题 ‎[3] 。

栽培大豆产量与品质的提升受到遗传瓶颈的制约 ‎[10] ‎[11] 。栽培大豆经历了几次遗传瓶颈，包括在当地的驯化、地方品种被引种到世界其它地区以及后来的选择育种，这些过程导致遗传多样性降低，是阻碍大豆改良的主要原因 ‎[12] 。野生大豆的遗传背景多样，可适应不同的生态环境，具有抵抗生物和非生物胁迫的特性。遗传多样性是作物改良的基础。大豆的野生近缘种具有相对较高水平的遗传多样性，尤其是多年生大豆，可以作为改良大豆的潜在基因资源 ‎[12] 。

大豆属植物资源多样性的研究一直是关注的热点，与其它植物一样，也经历了多个阶段，包括形态学、细胞学、同工酶和多种DNA分子标记阶段 ‎[10] 。目前，已经发展到全基因组研究时代 ‎[13] - ‎[23] 。基因组和转录组测序能够发现野生大豆中存在的、驯化过程中丢失的、与理想性状相关的等位基因。大豆野生近缘种的收集、保存以及基因组特征的剖析有助于促进大豆的育种和粮食生产的可持续发展 ‎[12]

多数文献主要侧重野生大豆和栽培品种两类资源的研究。例如，对31份大豆(包括野生大豆和栽培大豆品种)的全基因组重测序发现，野生大豆中等位基因多态性水平明显高于栽培大豆 ‎[24] 。对大豆品种‘齐黄34’的全基因组重测序，检测到1,519,494个单核苷酸多态位点，为分子标记辅助育种提供了丰富的标记资源 ‎[25] 。对中国6大生态区1024份大豆属Soja亚属的代表性材料(203份野生大豆、栽培大豆375份地方品种和446份现代育成品种)的简化基因组测序结果显示，存在“遗传瓶颈”和“单倍型新生”现象 ‎[11] 。在另一项研究中，利用不同生态区的182份一年生野生大豆、396份地方品种和446份育成品种组成的中国大豆种质资源群体，通过全基因组重测序，分析了大豆群体的基因组演化特征 ‎[26] 。利用228份普通大豆材料的重测序数据开发出100个二态DNA标记，用于大豆的基因型鉴定 ‎[27] 。组装了大豆属有代表性的多年生物种的基因组，包括5个二倍体和1个异源多倍体，为深度理解多倍体基因组进化和大豆的改良提供了遗传基础信息 ‎[28] ‎[29] 。利用高通量测序技术分析了野生大豆G. soja和大豆属的另外9个种的叶绿体全基因组的结构、基因组成、遗传变异和系统发育关系 ‎[30] 。

Table 1. Samples and Genbank accession numbers of chloroplast genome sequences used in this study

表1. 供试样品名称及叶绿体基因组序列号

注：食用葛(豆科Fabaceae葛属Pueraria DC.)为外类群对照

根据形态特征，全球的大豆属植物约有28种和亚种 ‎[1] ‎[2] ，隶属于被子植物的蔷薇目(Rosales)的豆科(Fabaceae)。基因编辑技术的进步使大豆属全部物种的基因资源进入了可利用范围。但是，尚未见到大豆属野生种资源多样性的分子分类检索表的报道。植物的叶绿体基因组的基因结构、组成以及基因数量高度保守，已广泛用于植物遗传多样性评价、物种的分子鉴定和系统发育关系研究 ‎[13] - ‎[23] 。本研究利用叶绿体全基因组序列的核苷酸变异位点，首次建立大豆属植物的分子鉴定检索表方法，对于大豆属植物种质资源的保护和可持续利用具有重要意义。

2. 材料与方法

Table 2. Base composition of variable nucleotide sites for classification of the seven species of Glycine

表2. 大豆属7个种的具有分类价值的核苷酸变异位点数目及碱基构成

续表

注：*该列的序号与检索表内的序号对应；**核苷酸变异位点数(在4种碱基中的占比)；***此列括号中，前一个数字是在物种特有变异位点总数(2363)中所占的比例；后一个数字是在全部核苷酸变异位点总数(3261)中所占的比例

Figure 1. Molecular taxonomic key to seven taxa in genus Glycine based on the species- specific variable nucleotide characters from the complete chloroplast genome

图1. 基于叶绿体基因组的物种特有核苷酸变异位点的大豆属7个种的分子分类检索表

供试样品的名称及其叶绿体基因组的序列号如表1 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)。7个样品代表大豆属的7个种。根据本团队发表的方法 ‎[14] ‎[15] ‎[16] ‎[17] ‎[31] ‎[32] ‎[33] 编制分子分类检索表。具体而言，首先，利用 MAFFTv7.055b软件 ‎[34] (http://mafft.cbrc.jp/alignment/software)获得比对序列矩阵。比对后的序列矩阵的长度为154,886个核苷酸，由左向右，左端(5’-端)起的第1个核苷酸字母的位置编号为1，最右端的核苷酸字母的位置编号为154,886。用MEGA 7.0 ‎[35] 和DnaSP v6软件 ‎[36] (http://www.ub.edu/dnasp/)检测核苷酸变异位点(图1，表2)。每个物种的特有核苷酸变异位点作为分子分类性状，用于编写大豆属植物的分子分类检索表(见图1)。以食用葛(Pueraria edulis Pamp.)作为外群对照，用MEGA 7.0软件的Tamura 3-parameter model参数模型推断遗传关系(图2)和计算遗传距离(表3)。

3. 结果

大豆属这7个种的叶绿体基因组的长度为152,518~153,023个核苷酸，比对序列的长度为154,886个核苷酸。在比对序列中，共检测到3261个核苷酸变异位点，占叶绿体基因组序列全长的~2.14%。其中，各物种的特有核苷酸变异位点数目的合计为2363个，占变异位点总数的72.46%。利用种级水平的特有核苷酸变异位点成功编制分子分类检索表，7个近缘种得到精准鉴定(图1和图2)。大豆的特有变异位点数量(1103个)最多，占物种特有变异位点总数的46.68%，依次为白毛烟豆(661个，27.97%)、镰荚烟豆(263个，11.13%)、短绒野大豆(129个，5.46%)、绢毛烟豆(86个，3.64%)、扁豆荚大豆(61个，2.58%)以及玫红野大豆(60个，2.54%) (表2)。在核苷酸构成方面，大豆、白毛烟豆、镰荚烟豆、绢毛烟豆以及扁豆荚大豆中，特有变异位点中的A或T的比例高于C和G；短绒野大豆中，A、T或C的比例均高于G；玫红野大豆中，T或G的比例高于A和C。特有变异位点的数量及其核苷酸构成存在种间差异(表2)。大豆位于大豆属的系统发育关系树状图的相对基部位置，与其余6个近缘种的遗传距离(0.01350~0.01391)都相对较远，扁豆荚大豆与玫红野大豆之间的遗传距离(0.00115)最近(表3)。

Table 3. Pairwise genetic distances between the seven species of Glycine based on complete chloroplast genome sequences

表3. 基于叶绿体全基因组序列的大豆属7种之间的遗传距离

4. 讨论

大豆的相关科学研究历史悠久。1929年，魏岩寿发表了中国的第一篇Science论文，也是中国首次用现代科学方法详细记述豆腐乳制造过程的论文 ‎[37] ‎[38] 。在北京的国家植物标本馆(PE)中，大豆属植物的目前馆藏标本共有3399份(https://www.cvh.ac.cn/spms/list.php?taxonName = Glycine)，约有10个种和亚种，最早的标本记录为1901年，其中，野大豆(Glycine soja Siebold & Zucc.)及其原亚种(Glycine soja subsp. soja，异名Glycine ussuriensis Regel & Maack)有2282份(占大豆属植物标本总数的67.14%)，大豆(也称黄豆，G. max) (异名Glycine hispida (Moench) Maxim.)有980份(28.83%)，宽叶蔓豆(G. gracei B. E. Pfeil & Craven)有54份(1.59%)，短绒野大豆G. tomentella (异名G. tomentosa Benth.)有40份(1.18%)，烟豆(G. tabacina (Labill.) Benth.) (异名G. clandestina J.C. Wendl.)有30份(0.88%)，绢毛烟豆(G. canescens)有5份(0.15%)，扁豆荚大豆(G. dolichocarpa)有3份(0.09%)，宽叶大豆(G. latifolia (Benth.) Newell & T. Hymowitz)有2份(0.06%)，车轴大豆(G. latrobeana (Meisn.) Benth.)有2份(0.06%)，小叶烟豆(G. microphylla (Benth.) Tindale)有1份(0.03%)。利用“Glycine”关键词查询到的标本中，有一些标本名称存在字母输入错误，也有一些标本名称实际上不是大豆属植物，而是其它属的植物的异名，例如，Glycine javanica L.、Glycine pinnata Merr.、Glycine hainanensis Merr. & F. P. Metcalf以及Glycine wightii (Wight & Arn.) Verdc.等，有待通过国家植物标本资源库和植物物种信息与大数据平台的反馈机制或专家立项进行整理。

Figure 2. Phylogenetic tree of the seven Glycine species based on complete chloroplast genome sequences using the neighbour-joining method with the Tamura3-parameter model. The numbers near the branches are bootstrap support values (%) of 1000 replications

图2. 基于叶绿体全基因组序列的大豆属7个种的系统发生关系。分支图中的数字为1000次重复抽样的自展支持率

没有馆藏标本的大豆属植物约18种，占该属植物全部种类的近64.3%，名称如下：1) 白花大豆(G. albicans Tindale & Craven)、2) 异色大豆(G. aphyonotos B. E. Pfeil)、3) 沙烟豆(G. arenaria Tindale)、4) 银毛烟豆(G. argyrea Tindale)、5) 弯果烟豆(G. curvata Tindale)、6) 紫斑果烟豆(G. cyrtoloba Tindale)、7) 镰荚烟豆(G. falcata)、8) 硬毛烟豆(G. hirticaulis Tindale & Craven)、9) 硬毛烟豆(原亚种) (G. hirticaulis subsp. hirticaulis)、10) 狭叶硬毛烟豆(亚种) (G. hirticaulis subsp. leptosa B. E. Pfeil)、11) 绿花大豆(G. lactovirens Tindale & Craven)、12) 白毛大豆(G. montis-douglas B. E. Pfeil & Craven)、13) 澎湖烟豆(G. pescadrensis Hayata)、14) 西澳烟豆(G. peratosa B. E. Pfeil & Tindale)、15) 单叶大豆(G. remota M. D. Barrett & R. L. Barrett)、16) 锈萼烟豆(G. rubiginosa Tindale & B. E. Pfeil)、17) 白毛烟豆(G. stenophita)以及18) 玫红野大豆(G. syndetika)。大豆属植物的自然分布范围较广(https://powo.science.kew.org/)，原产地包括俄罗斯、中国、朝鲜半岛、澳大利亚、日本、越南、菲律宾、老挝、马里亚纳群岛(Marianas)、斐济(Fiji)、新喀里多尼亚岛(New Caledonia)、新几内亚岛(New Guinea)、汤加(Tonga)、瓦努阿图(Vanuatu)等。经过100多年的标本采集，仅馆藏到大豆属全部28种中的约10种，还不足以支持在DNA分子水平上全面研究大豆属植物的分类鉴定和系统发育关系。对21国40个植物标本馆的4500份标本的调查显示，50%以上的热带植物标本的名称鉴定存在错误 ‎[39] ，植物鉴定仍然是具有挑战性的世界性课题。本研究显示，针对重要经济作物的野生近缘类群，标本馆的收集工作应该拓展至全球尺度上开展，而不局限于区域采集 ‎[39] ‎[40] ‎[41] 。通过全球生物多样性信息数据库(GBIF: Global Biodiversity Information Facility) (https://www.gbif.org/)和英国邱园的世界植物在线(Plants of the World Online) (https://powo.science.kew.org/)网络平台，可以获取大豆属植物分类和标本方面的大量信息。中国农业科学院作物科学研究所保存有野生大豆和栽培大豆资源8000份以上 ‎[42] 。因此，国际各植物标本馆之间复份标本的馆际交换能有效补全大豆属的其它物种的标本，分类学家和农作物专家配合标本馆联合开展，是推进相关研究的有效途径之一。本研究中的这7个种代表了大豆属植物的不同演化线，在大豆的长期驯化和育种过程中，其余6个种的基因资源尚未参与大豆的演化 ‎[12] ‎[26] ‎[42] ，表明利用基因编辑技术等先进手段 ‎[4] ‎[13] 改良大豆的潜力巨大。

致谢

本研究得到天津市人力资源和社会保障局及天津市人力资源建设服务中心宁波老师的大力支持。在调查过程中，得到王福彬、戎素平的热情支持和有意义的讨论。

基金项目

国家自然科学基金项目(No. 31770744)。

参考文献

NOTES

^*通讯作者。