基于生物信息学鉴定CCNB2为肾嫌色细胞癌进展的关键基因

Bioinformatics-Based Identification of CCNB2 as a Key Gene in the Progression of Chromophobe Renal Cell Carcinoma

摘要: 本研究旨在通过生物信息学方法筛选与肾嫌色细胞癌(Chromophobe renal cell carcinoma, chrcc)相关的生物标志物，作为预测chrcc预后的关键基因。GSE15641数据集从Gene Expression Omnibus (GEO)数据库中获取，共鉴定出1153个差异表达基因(DEGs)。随后，检测差异表达基因进行基因本体(GO)注释和京都基因基因组百科全书(KEGG)途径富集分析。此外，利用Cytoscape软件构建蛋白–蛋白相互作用(PPI)网络并可视化鉴定关键基因，包括KRAS、EGFR、EHHADH和CCNB2，根据Kaplan-Meier (K-M)生存分析，CCNB2是唯一重要的核心基因。根据我们的研究结果，CCNB2在The Cancer Genome Atlas(TCGA)-chrcc患者中的表达明显高于正常样本，并且CCNB2在癌症组织中的高表达与不良的临床病理因素有关。CCNB2高表达组与低表达组相比，总生存期(OS)和无进展间期(PFI)明显较差。同时，免疫浸润分析显示CCNB2表达与chrcc患者Th2细胞富集水平呈正相关，CCNB2表达与细胞毒性细胞和DC细胞呈负相关。最后，根据包括CCNB2基因在内的基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)富集结果，肝癌(HCC)亚类与乳腺癌(BC)的分类存在显著差异。在目前的工作中，CCNB2可以被认为是chrcc的预测性分子标记物和潜在的治疗靶点。

Abstract: The present work aimed to screen biomarkers associated with chromophobe renal cell carcinoma (chrcc) by bioinformatics methods as key genes to predict the prognosis of chrcc. The GSE15641 dataset was acquired from Gene Expression Omnibus (GEO) database, and totally of 1153 differentially expressed genes (DEGs) were identified. Thereafter, DEGs were detected to carry out Gene Ontology (GO) annotation and Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome (KEGG) pathway enrichment analysis. Moreover, the protein-protein interaction (PPI) networks were constructed and visualized using Cytoscape software to identify pivotal genes, including KRAS, EGFR, EHHADH and CCNB2, with CCNB2 being identified as the only significant core gene according to Kaplan-Meier (K-M) survival analysis. According to our results, CCNB2 expression was notably higher in The Cancer Genome Atlas (TCGA)-chrcc patients than in normal samples, and the high CCNB2 expression in cancer tissues was associated with adverse clinicopathological factors. The high CCNB2 expression group had markedly poor overall survival (OS) and progression-free interval (PFI) compared with low expression group. Meanwhile, immune infiltration analysis demonstrated a positive correlation between CCNB2 expression and Th2 cells enrichment levels in chrcc patients, and a negative correlation between CCNB2 expression and Cytotoxic cells as well as DC cells. At last, according to the Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) enrichment results including CCNB2 gene, there was a significant difference in the classification of hepatocellular carcinoma (HCC) subclass and breast cancer (BC). In the current work, CCNB2 can be considered as a predictive molecular marker and a potential therapeutic target for chrcc.

1. 前言

肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，全球大约每年新增超过43万例肾癌病人，超过17万人因肾癌去世 [1] ，尽管肾癌有很多的病理类型，嫌色细胞癌是肾癌中第三常见的亚型，大约占据4%~5% [2] ，众所周知，嫌色细胞癌是一种低度恶性的肿瘤，起源于肾集合管上皮，其临床表现多种多样。早期患者(病理I~III期)及时手术，也就是部分或者根治性肾切除可以达到治愈的效果 [3] ，其预后优于肾透明细胞癌，然而对于部分肿瘤复发、分期较晚(病理IV期)的患者，往往预后较差，仍需要其他辅助治疗，如免疫治疗和靶向治疗，目前有研究证明舒尼替尼和索拉非尼等药物在晚期肾癌患者中有着显著的效果 [4] ，即使如此，晚期肿瘤病人存活率仍较低，一线治疗方案仍不明确，因此，临床上更需要进一步挖掘嫌色细胞癌的分子机制，找到有效的生物标志物以及预后相关的基因对疾病的治疗有着重大意义，为实施合理的治疗提供一定的理论依据。

2. 材料与方法

2.1. 数据收集

通过GEO数据库下载高通量测序据集GSE15641，基因芯片数据类型为Expression profiling by array，种属为Homo sapiens，数据集注释平台为GPL96，其中包含有6个肾嫌色细胞癌、23个正常肾组织样本。

2.2. DEGs的提取和分析

在以上样本中，将原始数据分为肾嫌色细胞癌和正常肾组织组，使用GE02R在线分析工具分析并筛选出GSE15641数据集中的DEGs，筛选标准为p < 0.05并且log(FC)绝对值 > 1.0。

2.3. 功能富集分析

富集分析包括GO分析和KEGG通路分析。GO富集是组学数据分析常用的手段，包括：BP (biological process)，CC (cellular component)和MF (molecular function)三个方面对DEGs进行全面的注释。同时，KEGG数据库可以全面了解富集通路。使用DAVID工具对DEGs分别进行GO富集分析和KEGG信号通路分析，以图形方式进行可视化，以p < 0.05为差异有统计学意义。

2.4. PPI网络的构建及Hub基因的鉴定

使用String在线数据库工具构建了基于DEGs的PPI网络，并使用Cytoscape软件进行可视化，使用CytoNCA插件对PPI网络上所有DEGs进行评分，然后根据Betweennees、Degree、Network和Information四种算法对识别出的DEGs进行排序。

2.5. Hub基因的预后分析

TCGA，即癌症基因图谱计划，是一个用来研究癌症中基因组变化的数据库，我们从中选择肾嫌色细胞癌中TPM格式，用对获得的Hub基因采用Log-rank检验进行K-M生存分析。

2.6. CCNB2在TCGA数据库中的验证

从TCGA数据库中选择肾嫌色细胞癌89例(TPM数据)，使用R语言ggplot2包，用Wilcoxon秩和检验检测CCNB2在chrcc患者癌组织和正常组织中以及在配对组织中的表达水平是否有差异。我们同样采用Kruskal-Wallis test、Wilcoxon等检验方法，从总体生存期(OS)、无进展间隔(PFI)、疾病特异性生存期(DSS)、病理分期四个方面分析CCNB2表达与临床特征的关系。

2.7. 免疫浸润分析

为了探究CCNB2基因在chrcc中与免疫微环境的24种免疫细胞的表达程度的关系，我们基于R语言的GSVA包和ssGSEA算法计算肿瘤组织中免疫细胞的分数情况，以Spearman检验方法判断是否有相关性，筛选标准为p < 0.05。

2.8. 基因集富集分析(GSEA)

为了更加深入地寻找CCNB2基因富集的通路，我们使用R包“ClusterProfiler”工具，在MSigDB collections集合(c2.all.v7.0)中，以p < 0.05和FDR < 0.25作为筛选标准，确定显著差异的信号通路。

3. 结果

3.1. 差异基因的鉴定

通过分析共检测到1153个DEGs，其中上调基因469个，下调基因684个，通过绘制箱形图和PCA图进行可视化，如图1所示。箱形图中每个样本的中位数基本在一个水平上，说明样本之间的归一化程度较好，而PCA图上各组样本是分开的，说明两组之间差异明显。此外，DEGs的热图和火山图如图2所示，红色表示上调基因，蓝色表示下调基因。

Figure 1. Box plots (a) and PCA plots (b) for the samples of GSE15641 dataset

图1. GSE15641数据集样本的箱形图(a)和PCA图(b)

Figure 2. Heat map (a) and volcano map (b) for the samples of GSE15641 dataset

图2. GSE15641数据集样本中的热图(a)、火山图(b)

3.2. GO和KEGG富集分析

根据富集结果(图3)，DEGs主要富集到BP方面，包括有机阴离子转运、糖酵解/糖异生、对金属离子的响应、对肾脏系统发育的响应；CC如细胞的根尖部分、根尖质膜、含有胶原蛋白的细胞外基质和分泌颗粒的管腔；而MF包括受体配体活性、阴离子跨膜转运蛋白活性、辅酶结合和有机阴离子跨膜转运蛋白活性。KEGG通路富集表明补体和凝血级联、糖酵解/糖异生、矿物质摄取、精氨酸和脯氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、肾素–血管紧张素系统和类固醇生物合成等途径显著富集。

Figure 3. BP (a), CC (b), MF (c) and KEGG (d) enrichment results of DEGs

图3. DEGs的BP (a)，CC(b)，MF (c) and KEGG (d)富集结果

3.3. PPI相互作用与枢纽基因鉴定

根据每个标准选出的前50个基因如图4(a)~图4(d)所示，其中圆圈直径越大，得分越高，预示着关联越强。将得分最高的15个DEGs作为枢纽基因(表1)，然后分析相互作用，得到4个重叠的枢纽基因，分别是KRAS、EGFR、EHHADH和CCNB2 (图4(e))。

3.4. K-M生存分析曲线

从曲线上可以看出，CCNB2基因低表达比高表达预后更好，两组患者生存时间差异有统计学意义(见图5)，因此检测CCNB2是chrcc中具有临床意义的核心基因。

Figure 4. The top 50 Hub genes were screened according to the Betweenness (a), Degree (b), information (c) and Network (d), interaction according to the Betweenness, Degree, Information and Network (e)

图4. 根据Betweenness (a)、Degree (b)、information (c)和Network (d)筛选前50个Hub基因，根据Betweenness、Degree、Information and Network进行交互(e)

Table 1. Top 15 hub genes sorted out according to Betweenness, Degree, Network and Information.

表1. 根据Betweenness、Degree、Information and Network的前15个中心基因

Figure 5. Survival analysis curve of the KRAS (a), EGFR (b), EHHADH (c), and CCNB2 (d)

图5. KRAS (a)、EGFR (b)、EHHADH (c)、CCNB2 (d)的生存分析曲线

3.5. 数据验证

根据我们的研究结果，相对于25个正常组织，65个chrcc肿瘤组织中CCNB2明显上调(图6(a))。此外，在24对肿瘤组织中也有高表达(图6(b))。经统计分析，CCNB2与OS、PFI、DSS及病理分期有显著相关性(图6(c)~图6(f)) (p值 < 0.05)。

Figure 6. CCNB2 expression levels in chrcc and normal tissues (a), CCNB2 expression levels in chrcc patients and matched normal tissues (b), association of CCNB2 expression with clinical features containing OS (c), PFI (d), DSS (e), and pathological stage (f)

图6. CCNB2在chrcc和正常组织的表达水平(a)，chrcc患者和匹配的正常组织中的CCNB2表达水平(b)，CCNB2表达与临床特征的关联：总生存期(c)、无进展间隔(d)、疾病特异性生存期(e)、病理分期(f)

3.6. 免疫浸润

研究发现，在有统计学意义前提下，CCNB2水平与Th2 cells浓集水平呈正相关。此外，CCNB2水平与Cytotoxic cells、DC、iDC、Tgd、B cells、Th17 cells、Neutrophils等浓集程度呈负相关，其中图7(a)的圆圈的颜色深浅代表p值的大小。

3.7. GSEA富集

我们共鉴定出301条显著通路，其中只有2条含有CCNB2基因(表2)，包括肝癌亚类和乳腺癌分级(图7(b)，图7(c))。这表明CCNB2基因在chrcc发病过程中与肝细胞癌和乳腺癌存在关联。

4. 讨论

在本次的研究中，我们选择了数据集GSE15641，鉴定了1153个DEGs，为了研究其相互作用，

Figure 7. Relationship between the CCNB2 gene and infiltration levels of 24 kinds of immune cells (a), GSEA of the CCNB2 gene ((b), (c))

图7. CCNB2基因与24种免疫细胞浸润水平的关系(a)，CCNB2基因的GSEA富集((b), (c))

Table 2. GSEA of the CCNB2 gene

表2. CCNB2基因的GSEA

我们对DEGs进行GO富集分析，其中有机阴离子运输、糖酵解/糖异生、细胞顶端部分、顶端质膜、受体配体活性、阴离子跨膜转运蛋白活性富集程度较高。而KEGG包括补体和凝血级联、糖酵解/葡萄糖生成、矿物质吸收等7条通路途径。基于DEGs建立了PPI网络，使用CytoNCA插件，根据Betweennees、Degree、Network和Information算法获得4个Hub基因，即KRAS、EGFR、EHHADH、CCNB2，而通过KM生存分析，我们确定了CCNB2为唯一有临床意义的核心基因。更进一步，通过TCGA数据库验证CCNB2在肿瘤组织中的表达情况，我们发现肿瘤组织的CCNB2表达明显高于正常样本，不仅如此，研究还发现癌组织中CCNB2的高表达与不好的临床病理因素有密切关系，这表明了CCNB2很可能在肿瘤的进展中发挥重要的作用，因此，根据以上的研究，我们合理推测CCNB2是chrcc有效的生物标志物。

细胞周期蛋白，包括细胞周期蛋白A、B、C、D、E等，在有丝分裂的G1-S期中与周期蛋白依赖性激酶(CDK)结合形成复合物，并激活相应的蛋白激酶，控制着细胞有序的生长和分裂 [5] 。根据既往的研究，CDK1/CCNB形成复合物共同控制细胞周期中G2/M期转变，而且CCNB2可调节细胞周期G2/M期，从而抑制鼻咽癌细胞凋亡 [6] [7] ，因此，我们推测CCNB的表达水平可以影响细胞的增殖及分裂，当细胞分裂不能受到自主控制而无限分裂时，它就倾向转变为癌细胞，故CCNB基因家族被认为在肿瘤的进展中扮演重要作用。除此之外，Thomas K Hoffmann论证了CCNB1在头颈部鳞状细胞癌中过表达与肿瘤高分级显著相关 [8] 。更进一步，CCNB2在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌等多种肿瘤中都高度表达 [9] [10] [11] [12] ，这充分表明了CCNB2有可能是一个癌基因。通过这项研究，我们可以初步预测CCNB2是chrcc预后不良的生物标志物，但目前CCNB2在chrcc的作用机制尚不清楚，我们仍需要大量的标本及实验去探索。

肿瘤微环境(Tumor microenvironment, TME)指肿瘤的发生、生长、转移以及肿瘤细胞所处的内外环境，不仅包括肿瘤细胞，还有与肿瘤细胞密切相关的炎性细胞和免疫细胞。我们知道，肿瘤依赖于TME的紊乱，最终损害免疫细胞的代谢功能，从而更加容易地发生远处转移 [13] ，肿瘤细胞和TME在发展过程中会不断发生相互作用，TME通过免疫细胞的肿瘤浸润影响肿瘤的发生和发展 [14] [15] ，TME长期以来就是肿瘤研究方向的热点与核心，对于肿瘤的认识及治疗有着重要意义，例如CCNB1和CCNB2高表达水平可以影响肝细胞癌中的肿瘤微环境的免疫活性，并且与预后不良相关 [16] 。根据此次分析，我们得到了CCNB2表达增加与Th2 cells浓集水平呈正相关，此外有研究表明IL-4与受体结合导致TH2细胞因子分泌，最终致使肿瘤生长和转移 [17] [18] ，而且TH2细胞的存在与预后不良有关 [19] [20] 。除此之外，CCNB2表达增加与Cytotoxic cells、DC细胞呈相反的趋势，Cytotoxic CD4 T cells与DC细胞作为免疫系统的关键细胞，也时刻监视着肿瘤细胞的进展，其中CD4 T细胞产生IFN-γ以GZMB和PRF1方式可以直接杀死肿瘤细胞 [21] ，而且化疗、放疗、小分子抑制剂、免疫治疗和肠道菌群等癌症疗法都可以依赖于DC细胞而发挥作用 [22] ，因此，我们推测CCNB2基因通过影响肿瘤的免疫微环境去影响chrcc的预后。

基于GSEA富集分析，我们得到了2条包括CCNB2基因的通路：肝癌亚类和乳腺癌分级，而在这之前，有实验表明CCNB2基因可能通过增加JAG1表达来促进肝癌的增殖和转移 [23] ，且乳腺癌中CCNB2的上调有助于淋巴血管浸润的发展 [10] ，CCNB2基因已经被证实与肝癌和乳腺癌的不良预后密切相关，这在一定程度上表明了CCNB2在致病方面与肝癌及乳腺癌有一定的关联。通过这次研究，我们发现CCNB2基因高表达意味着chrcc患者有不好的临床结局，但根据已有参考文献，尚未有研究揭示他们之间的相关性以及作用机制，简而言之，我们仍需要大量实验研究去论证这个观点的可靠性。

5. 结论

在chrcc患者中，CCNB2的高表达可能通过调节免疫微环境和免疫细胞的表达水平影响其不良预后。同时，CCNB2在发病机制上可能与肝细胞癌和乳腺癌存在关联。因此，CCNB2可作为chrcc的预测性分子标记物和潜在的治疗靶点。

基金项目

重庆市自然科学基金项目(cstc2021jcyj-msxmX0484)、国家自然科学基金项目(No. 81801507)和重庆医科大学附属第二医院宽仁人才计划项目(KY2019Y004)资助。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。